Riassunto analitico
Questo progetto è focalizzato sulla trasformazione di diverse sostanze fitochimiche da parte del microbiota intestinale e di bifidobatteri. È stata studiata la trasformazione dell’acido clorogenico (CQA) in acido caffeico (CA, meglio assorbito dall’intestino) da parte dei bifidobatteri, tra i quali solo gli appartenenti alla specie B. animalis sono risultati capaci di catalizzare l’idrolisi del CQA. Studi in silico di comparative modelling hanno identificato in Balat 0669 l’esterasi responsabile dell’attività enzimatica, come confermato dalla sua espressione in E. coli. Per esplorare la variabilità interindividuale del metabolismo microbico del CQA, la trasformazione è stata studiata in nove diversi campioni fecali. In tutti i campioni il metabolismo convergeva sull’acido 3(3idrossifenil) propanoico, preceduto da un complesso spettro di metaboliti, alcuni dei quali descritti per la prima volta come metaboliti del CQA. La valutazione della possibile influenza di un ceppo probiotico sul metabolismo del CQA è stata effettuata allestendo fermentazioni continue di microbiota addizionato di B. animalis subsp. lactis WC0432, ceppo in grado di idrolizzare il CQA. Il probiotico ha modificato la composizione del microbiota, ma non in misura tale da influenzare il metabolismo del CQA, suggerendo che altre vie metaboliche diverse dall’idrolisi dell’estere siano preponderanti nell’intestino. Il secoisolariciresinolo (SECO) è un lignano che si trova, nella sua forma diglicosilata (SDG), in diversi alimenti ricchi di fibra, specialmente i semi di lino. Ha proprietà antiossidanti e i suoi metaboliti enterodiolo ed enterolattone sono fitoestrogeni, cioè mimano le proprietà degli estrogeni umani. La trasformazione dell’SDG è stata monitorata in un modello batch in vitro, inoculato col microbiota di cinque campioni fecali. Le popolazioni microbiche hanno generato differenti cinetiche di conversione di SDG e SECO e spettro di metaboliti prodotti, alcuni dei quali non ancora descritti. Tuttavia, gran parte del SECO era ancora presente dopo 24 h di incubazione. L’aggiunta di un bifidobatterio in grado di convertire SDG in SECO non ha cambiato le cinetiche del processo. Per paragonare i risultati ottenuti in vitro con i processi in vivo sono stati analizzati campioni di feci e urina degli stessi cinque volontari dopo una settimana di supplemento alimentare di semi di lino (25 g al giorno). Un’altra fonte di fitochimici nella dieta è la crusca di frumento, ricca di acidi ferulici. Quattro campioni fecali sono quindi stati incubati in fermentatore continuo con crusca di frumento come unica fonte di carbonio. L’acido 3idrossifenil propanoico è risultato essere il maggiore prodotto di conversione microbica, mentre altri metaboliti presentavano grosse differenze interindividuali. La caratterizzazione della comunità microbica tramite sequenziamento Illumina ha identificato tre OTU della famiglia delle Lachnospiraceae il cui sviluppo era promosso nella fermentazione. In parallelo, studi simili sono stati effettuati su colture pure di batteri intestinali, per investigare quali specie siano responsabili della degradazione primaria e secondaria della crusca di frumento. Gli studi precedenti, volti a selezionare ceppi probiotici che migliorino la biodisponibilità dei fitochimici, evidenziano l’importanza di poter tracciare questi ceppi in vivo. È stata quindi valutata la disponibilità di un terreno efficiente per isolare e quantificare lattobacilli e bifidobatteri fecali paragonando i dati ottenuti con 5 diversi terreni selettivi e alcune tecniche molecolari (FISH, qPCR, TRFLP). Mentre l’isolamento dei bifidobatteri tramite tecniche di coltura è risultato efficiente, l’isolamento e la quantificazione dei lattobacilli ha fornito risultati contrastanti, suggerendo che un terreno selettivo per l’isolamento dei lattobacilli fecali non è ancora disponibile.
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Abstract
The major topic of this project was the transformation of different phytochemicals by gut microbiota and by potentially probiotic bifidobacteria. The transformation by bifidobacteria of chlorogenic acid (CQA) into caffeic acid (CA), an antioxidant metabolite better absorbed in the gut, was investigated. The major species occurring in the human colon were analysed. Only bifidobacteria belonging to the B. animalis species were capable of this transformation. In silico studies and comparative modelling identified Balat 0669 as the cytosolic esterase responsible of the enzymatic activity. The expression in E. coli of Balat 0669 confirmed its role in CQA hydrolysis. In order to explore the interindividual variability of CQA metabolism by colonic microbiota, transformations with faecal inocula from nine volunteers were carried out. A complex spectrum of metabolites was found, with all the pathways converging on 3(3hydroxyphenyl) propanoic acid. Some of the compounds identified were described for the first time as microbiota metabolites of CQA. To evaluate whether the fate of CQA may be modified by the presence of a probiotic strain able to hydrolyze CQA to CA, continuous microbiota cultures were supplemented with B. animalis subsp. lactis WC0432. The probiotic affected microbiota composition but not to such an extent that CQA metabolism was modified, suggesting that the ester hydrolysis of CQA, may be bypassed by other pathways. Secoisolariciresinol (SECO) is a lignan, found mainly in its diglucoside form (SDG) in many dietary fibres, especially flaxseed. It has antioxidant activity and its metabolites enterodiol and enterolactone are phytoestrogens, i.e. compounds that can mimic the properties of human oestrogens. The transformation of SDG was monitored in a batch in vitro model inoculated with the microbiota of five faecal samples. Different microbiota showed dissimilarities in terms of both kinetics of SDG and SECO conversion and of spectrum of produced metabolites, a few of them never described. However, most of SECO was still not metabolised after 24h incubation. The addition of a probiotic Bifidobacterium able of converting SDG into SECO did not change metabolic kinetics of the process. Flaxseeds were administered to the same five volunteers (25 g per day for 1 week) and faecal and urine samples were analysed to compare the metabolites produced in vivo and in vitro. Another contributor to fibre intake in humans is wheat bran, rich in ferulic acids. Four faecal samples were grown in an anaerobic in vitro model, with wheat bran as sole carbon source. The release of ferulic acid led to the production of 3OHphenylpropanoic acid as main conversion product, with interindividual variations for other metabolites. The characterization of microbial community by Illumina sequencing detected three OTUs from Lachnospiraceae family that were promoted during the fermentation process. Concurrently, similar studies were performed on single strains of gut bacteria, to investigate which species were responsible for primary and secondary degradation of wheat bran. Since the previous activities related to metabolism of phytochemicals are aimed to the development of properly selected strains to enhance the availability of bioactive metabolites, it is important to be able to trace the probiotic strains in vivo. A further goal of the project was to evaluate the availability of proper media to enumerate and isolate from faecal samples lactobacilli and bifidobacteria, in order to trace probiotics. Data obtained using 5 diverse selective media and by molecular techniques (FISH, qPCR, TRFLP) were compared. While the isolation of bifidobacteria through culture techniques proved to be reliable, lactobacilli isolation and quantification gave conflicting results, suggesting that a selective medium for isolation of lactobacilli from faeces is not available yet.
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