Riassunto analitico
La capacità di garantire una corretta omeostasi proteica o proteostasi è un fattore fondamentale per assicurare l’efficace svolgimento delle normali funzioni cellulari. Per realizzare ciò, esiste una famiglia molto conservata di proteine denominate chaperoni molecolari, che sono in grado di mantenere il corretto ripiegamento o folding di altre proteine, dette clienti, e di prevenirne l’aggregazione, sia in contesti fisiologici che in condizioni di stress. L’attività di queste proteine fa parte di un processo biologico noto come sistema di controllo di qualità proteico (in inglese protein quality control o PQC), che comprende l’insieme dei meccanismi biologici deputati a sorvegliare il corretto folding proteico e la clearance o smaltimento delle proteine non ripiegate in modo idoneo (unfolded e misfolded). In questa tesi ci si è concentrati su un particolare chaperone molecolare, HSP90 (90-KDa Heat Shock Protein). HSP90 è una proteina dimerica che interagisce con molti substrati proteici o clienti per regolarne l’attività; fra i possibili clienti di HSP90 figurano le chinasi della famiglia DYRK (Dual specificity tyrosine-phosphorylation-regulated kinases), che comprende i membri DYRK1A, DYRK1B, DYRK2, DYRK3 e DYRK4. Particolare attenzione è stata concentrata recentemente sul membro DYRK3, oggetto del lavoro di questa tesi. Dato che DYRK1A è stato identificato precedentemente come cliente di HSP90, lo scopo di questa tesi prevedeva di indagare se DYRK3 è un nuovo cliente di HSP90 e se la sua stabilità e degradazione dipendano dai livelli di espressione e dall’attività del chaperone HSP90. Perciò, sono stati condotti una serie di esperimenti su cellule tumorali immortalizzate umane (HeLa) nelle quali si è verificata l’interazione diretta fra HSP90 e DYRK3 attraverso metodiche quali l’immunoprecipitazione e la PLA (proximity ligation assay). Inoltre HSP90 è stata inibita con l’impiego di agenti chimici quali Geldanamicin (GA) e 17-N-allylamino-17-demethoxygeldanamycin (17AAG), inibitori dell’attività ATPasica di HSP90 e mediante deplezione. La deplezione di HSP90 è stata ottenuta mediante silenziamento genico con specifici siRNA. Nelle cellule con HSP90 inibita o depleta è poi stata monitorata la stabilità di DYRK3. I risultati ottenuti dimostrano che DYRK3 è un nuovo cliente di HSP90. La scoperta di DYRK3 come nuovo cliente di HSP90 permette di rafforzare il ruolo di questo chaperone nel corretto funzionamento cellulare. Infatti HSP90, preservando il corretto ripiegamento dei suoi innumerevoli clienti proteici, regola indirettamente funzioni fondamentali quali il metabolismo cellulare, la riparazione del DNA e la risposta immunitaria.
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Abstract
The ability to guarantee the correct protein homeostasis or proteostasis is fundamental for the effective execution of normal cellular functions and for life. Cells evolved a very sophisticated system to maintain proteostasis. This system, referred to as the protein quality control system (PQC) consists of molecular chaperones and degradative systems. Molecular chaperones represent a very conserved family of proteins that are able to maintain the correct folding of other proteins, named clients, preventing their irreversible aggregation, both in physiological and stressful conditions. In this thesis we focused on a particular molecular chaperone, HSP90 (90-KDa Heat Shock Protein). HSP90 is a dimeric protein that interacts with many protein clients to regulate their stability and activity; among the possible clients of HSP90 there are the kinases of the DYRK family (Dual specificity tyrosine-phosphorylation-regulated kinases), which includes the members DYRK1A, DYRK1B, DYRK2, DYRK3 and DYRK4. Particular attention has recently been focused on the member DYRK3, which is object of the work of this thesis. Since DYRK1A was previously identified as a client of HSP90, the purpose of this thesis was to investigate if DYRK3 is a new client of HSP90 and whether its stability and degradation depend on the expression levels and activity of the HSP90 chaperone. Therefore, we conducted a series of experiments on human immortalized tumor cells (HeLa) to test the direct interaction between HSP90 and DYRK3, using methods such as immunoprecipitation and PLA (proximity ligation assay). In addition, we inhibited the ATPase activity of HSP90 with chemical agents such as Geldanamicin (GA) and 17-N-allylamino-17-demethoxygeldanamycin (17AAG) or we depleted HSP90 by gene silencing with specific siRNAs. We monitored the stability of DYRK3 under conditions of HSP90 inhibition or depletion. The results obtained demonstrate that DYRK3 is a new client of HSP90. The discovery of DYRK3 as a new client of HSP90 strengthens the role of this chaperone in the regulation of fundamental physiological functions that range from the regulation of cellular metabolism, DNA repair and the immune response. HSP90 achieves these functions through the preservation of the correct folding of its innumerable protein clients.
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