Riassunto analitico
La tecnologia delle cellule staminali ha recentemente richiamato molta attenzione grazie all’enorme potenziale dimostrato nell’estendere, in numerose terapie, le capacità di recupero e di riparazione dei tessuti del corpo umano a seguito di molte malattie e lesioni, facendo fronte a disturbi spesso non risolvibili da procedure mediche attualmente esistenti.
Sebbene tale tecnologia sia una potenziale risorsa nella medicina rigenerativa, nell’ingegneria tissutale e nelle tecnologie di sostituzione delle cellule, i progressi rimangono limitati a causa d’importanti lacune nella conoscenza del campo, così come nei processi di differenziazione e di un sufficiente controllo d’innesco alla differenziazione.
Analogamente anche la nanotecnologia è stata riconosciuta un settore di punta nella ricerca scientifica in quanto potenzialmente dotata molteplici applicazioni, dalla diagnostica alla terapia, grazie all’eccezionale interazione dei materiali di dimensioni nanometriche con le biomolecole e i sistemi biologici.
In questa tesi, la combinazione di queste due tecnologie è stata utilizzata per ampliare la comprensione della differenziazione nelle cellule staminali, ma anche per monitorare i possibili effetti che le particelle della dimensione del nanometro possono avere su tale processo.
È stato dimostrato che la Spettroscopia Raman può rappresentare un formidabile strumento analitico, per l’analisi ad alta risoluzione di tessuti, cellule, fluidi corporei, completamente privo di marcatura e manipolazione invasiva del campione.
Tale capacità diagnostica è stata applicata allo studio della differenziazione delle cellule staminali mesenchimali (MSC), monitorando il processo sistematicamente con e senza esposizione alle nanoparticelle (NPs); successivamente, in seguito all’esposizione per uno stabilito intervallo di tempo, sono state rilevate e analizzate le deviazioni dal naturale processo di differenziazione.
Mediante alcune tecniche quali la spettroscopia UV/Vis, la microscopia elettronica a scansione (SEM), la microscopia a scansione laser confocale (CLSM) e Dynamic Light Scattering (DLS), le NPs a base di polistirene modificate con carbossile (PS-COOH) sono state identificate e caratterizzate.
I possibili contributi di PS-COOH, così come gli eventuali effetti tossici sono stati esaminati utilizzando saggi di citotossicità comunemente utilizzati e ben consolidati, come i sali di Alamar blu e tetrazolio.
La differenziazione delle MSC in osteociti e condrociti è stata indotta mediante l’impiego di un kit di differenziazione e la microscopia Raman ha consentito un’identificazione di specifici marcatori spettrali per un periodo empiricamente prestabilito di 7 e 14 giorni, mentre Le modifiche morfologiche rilevate nelle cellule sono state monitorate mediante la microscopia a scansione laser confocale (CLSM).
I set dei dati ricavati sono stati trasferiti al software Matlab e analizzati utilizzando alcuni noti algoritmi, quali K-means clustering (KMCA) e Principal component analysis (PCA).
Infine, è stato studiato l'effetto delle NPs sulla differenziazione delle cellule staminali dopo 7 e 14 giorni e le differenze registrate nei marcatori spettrali in seguito all'esposizione a PS-COOH sono state monitorate usando la microspettroscopia Raman.
Nel complesso, dai risultati si evince una vantaggiosa applicabilità della microspettroscopia Raman nello studio delle caratteristiche biochimiche delle cellule staminali e nell’identificazione dei marcatori spettrali della differenziazione cellulare. È stato in oltre osservato un significativo e promettente effetto in risposta all’esposizione alle NPs, un considerevole progresso orientato alla conoscenza e alla padronanza degli eventi cellulari che regolano il controllo della differenziazione.
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Abstract
Stem cell technology has attracted considerable attention due to its enormous potential to extend the recovery capabilities of the human body following many diseases and injuries, which are not treatable by current medical procedures. Although Stem cell technology has a significant potential in regenerative medicine, tissue engineering and cell replacement technologies, progress in the field remains limited due to lack of knowledge on stem cells, their differentiation processes and also insufficient control and trigger of differentiation.
Similar to Stem cell technology, Nanotechnology has been demonstrated to have an enormous potential for many applications, from diagnostics to therapeutics, due to the ease of interaction of nano-sized materials with biomolecules and biological systems. In this thesis, a combination of these two emerging technologies was used to expand the understanding of stem cell differentiation and also to monitor possible effects of nanoparticles on the process, which could eventually lead to controlled triggering of differentiation.
Raman spectroscopy has been demonstrated to be a powerful analytical tool, which provides detailed label free biochemical fingerprint information in a non-invasive way, for analysis of cells, tissues and body fluids. Therefore, Raman Spectroscopy is explored to monitor and investigate the mechanism of stem cell differentiation based on biochemical and spectral markers, providing improved understanding of cellular events governing the differentiation.
Differentiation of Mesenchymal stem cell (MSCs) into Osteocytes and Chondrocytes was monitored systematically with and without nanoparticle exposure, and deviations from the natural process of differentiation, upon exposure to the nanoparticles, was investigated.
Carboxyl-modified polystyrene nanoparticles (PS-COOH) were identified and characterised through UV/Vis spectroscopy, Scanning Electron Microscopy (SEM), Confocal laser scanner microscopy (CLSM) and Dynamic Light Scattering (DLS). In order to investigate the possible contributions from PS-COOH, the cytotoxic effects of the nanoparticles were examined using commonly used and well-established cytotoxicity assays, such as Alamar blue and tetrazolium salts.
Differentiation of MSCs into osteocytes and chondrocytes was induced using differentiation kits and spectral markers of differentiation were identified after 7 and 14 days using Raman microsopectroscopy. The Raman spectral data sets were transferred to Matlab and analysed using K-means clustering (KMCA) and Principal components analysis (PCA). The morphological changes to the cells during the differentiation were also monitored using confocal laser scanner Microscopy (CLSM).
The effect of nanoparticles on stem cell differentiation was also investigated after 7 and 14 days of differentiation and differences in spectral markers of differentiation events upon PS-COOH exposure were monitored using Raman microspectroscopy.
Overall, the results showed the applicability of Raman microspectroscopy to investigate biochemical features of stem cells and to identify spectral markers of cell differentiation. A significant effect was also observed upon nanoparticle exposure which can ultimately potentially be used to control stem cell differentiation.
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