• BV-2
• HPLC-MS/MS
• microglia
• neuroinfiammazione
• neurosteroidi

Uno dei tratti condivisi da varie malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Parkinson, la malattia di Alzheimer e la Sclerosi Laterale Amiotrofica, è la neuroinfiammazione mediata dalla microglia. Le cellule microgliali, nel fenotipo a riposo sintetizzano neurosteroidi e in seguito a danno ossidativo la produzione steroidea aumenta e la cellula assume un fenotipo M1 infiammatorio. Nel tentativo di ripristino di un equilibrio omeostatico la microglia assume poi un fenotipo M2 antiinfiammatorio.
Lo scopo della presente tesi di laurea è stato quello di valutare una possibile modulazione della steroidogenesi nelle cellule microgliali e in particolare si è voluto verificare l’inibizione della sintesi dei neurosteroidi in seguito all’esposizione della linea cellulare murina BV-2 al trilostano, un inibitore competitivo della 3β-idrossisteroido deidrogenasi. Dopo 8 e 24h di esposizione al trilostano (25 µM) è stata eseguita una quantificazione di neurosteroidi mediante una cromatografia liquida associata ad un’analisi di spettrometria di massa LC-MS/MS. Nello specifico sono stati quantificati pregnenolone, pregnenolone solfato, progesterone, 5α-diidroprogesterone (DHP), pregnanolone e allopregnanolone sia nel medium di coltura che nelle cellule.
I campioni necessitano di una estrazione in fase solida (SPE) per purificare e concentrare gli analiti di interesse. Per migliorare poi l’efficienza di ionizzazione è stata condotta una derivatizzazione pre-colonna con reagente amminoossi quaternario (QAO), il O-(3-trimetilammonio-propil) idrossilammina) bromuro. Si viene così a creare un legame ossimico tra il gruppo carbonilico dei neurosteroidi e l’amminossi del reattivo e viene introdotta una porzione trimetilamminica carica positivamente, facilmente rilevabile dall’interfaccia ESI positiva. La colonna analitica utilizzata era una colonna a fase inversa C18, il programma di eluizione era a gradiente e l’analizzatore di massa era un triplo quadrupolo QQQ-MS/MS nella modalità Multiple Reaction Monitoring.
L’esposizione al trilostano 25 µM per 8h ha ridotto in modo significativo la concentrazione nel medium cellulare del progesterone e dei suoi metaboliti, il 5α-DHP e il pregnanolone. Alle 24h di esposizione la concentrazione degli stessi neurosteroidi diminuisce ma in misura minore. L’azione del trilostano è quindi massima nelle 8 ore e nelle ore successive l’effetto diminuisce. Tale inibizione è rilevabile anche all’interno della cellula, dove è stata riscontrata una diminuzione significativa dei livelli di progesterone e 5α-DHP. Inoltre il pregnenolone era presente in egual quantità all’interno e all’esterno della cellula, mentre gli altri neurosteroidi oggetto di indagine hanno una localizzazione preferenzialmente intracellulare.
In conclusione è stato quantificato per la prima volta il contenuto intracellulare di alcuni neurosteroidi ed è stato dimostrato che la via steroidogenica presa in considerazione risulta essere modulabile. Il targeting di enzimi steroidogenici può rappresentare un utile approccio terapeutico per ripristinare le concentrazioni di neurosteroidi in disturbi neurodegenerativi, in cui spesso si ha un calo di neurosteroidi neuroprotettivi.

One of the hallmarks shared by various neurodegenerative diseases, including Parkinson's disease (PD), Alzheimer's disease (AD), and Amyotrophic Lateral Sclerosis (SLA), is microglia-mediated neuroinflammation. In the resting phenotype, microglia synthesizes neurosteroids and following oxidative damage, steroid production increases and cell activates an inflammatory M1 phenotype. In an attempt to restore a homeostatic equilibrium, the microglia takes on an anti-inflammatory M2 phenotype. The aim of this thesis is to evaluate a possible modulation of steroidogenesis in microglial cells and in particular we want to verify the inhibition of neurosteroid synthesis following the exposure of the murine BV-2 cells to trilostane, a competitive inhibitor of 3β-hydroxysteroid dehydrogenase. After 8 and 24 hours of exposure to trilostane (25 µM), quantification of neurosteroids was performed by liquid chromatography associated with an LC-MS/MS mass spectrometry analysis. Specifically, pregnenolone, pregnenolone sulfate, progesterone, 5α-dihydroprogesterone (DHP), pregnanolone and allopregnanolone were quantified both in the culture medium and in cells. Samples require solid phase extraction (SPE) to purify and concentrate the analytes of interest. To improve the ionization efficiency, a pre-column derivatization was carried out with aminooxy quaternary reagent (QAO), the O- (3-trimethylammonium-propyl) hydroxylamine) bromide. An oxymic bond is created between the carbonyl group of the neurosteroids and the aminooxy of the reagent and a positively charged trimethylamine portion is introduced, easily detectable by the positive ESI interface. The analytical column used was a reverse phase C18 column, the elution program was gradient and the mass analyzer was a QQQ-MS/MS triple quadrupole in Multiple Reaction Monitoring mode. Exposure to 25 µM trilostane for 8h significantly reduced in medium the concentration of progesterone and its metabolites, 5α-DHP and pregnanolone. At 24 hours of exposure the concentration of the same neurosteroids decreases but to a lesser extent. The action of trilostane is maximum in 8 hours and in the following hours the effect decreases. This inhibition is also detectable inside the cells, where a significant decrease in progesterone and 5α-DHP levels was found. In addition, pregnenolone was present in equal quantities inside and outside the cell, while the other neurosteroids under investigation have a preferentially intracellular localization. To conclude, the intracellular content of some neurosteroids has been quantified for the first time and there is evidence that the steroidogenic pathway under consideration is modulable. The targeting of steroidogenic enzymes may represent a useful therapeutic approach to restore neurosteroid concentrations in neurodegenerative disorders, in which there is often a decline in neuroprotective neurosteroids.