Riassunto analitico
La pelle è un organo le cui funzioni principali sono quelle di rivestire e proteggere l'organismo e di permetterne i rapporti con il mondo esterno. Per esercitare queste funzioni le cellule dell’epidermide, ossia lo strato più esterno della pelle, devono per forza aderire tra loro ed alla membrana basale. Le cellule epidermiche, o cheratinociti, sono tenute insieme da giunzioni ancoranti quali i desmosomi, che donano alla pelle la resistenza ai traumi fisici. Esistono diverse patologie che tendono a compromettere la compattezza della cute. Alcune invalidano gravemente l'individuo, soprattutto quelle autoimmunitarie come il pemfigo. Il pemfigo è una malattia rara e cronica della pelle, dovuta dalla presenza di autoanticorpi specifici che legano le desmogleine (Dsg), glicoproteine che costituiscono l’impalcatura dei desmosomi cutanei. Il legame autoanticorpo-desmogleina induce la perdita dei ponti intercellulari tra i cheratinociti e la formazione di bolle, fenomeno detto acantolisi. Esistono due forme principali di pemfigo: pemfigo foliaceo (PF) e pemfigo volgare (PV). Il PF si presenta sotto forma di lesioni vescicolose nella parte superficiale della cute, in presenza di anticorpi anti-Dsg1. Il PV invece è caratterizzato da vescico-bolle nelle membrane mucose, in presenza di anticorpi anti-Dsg3. Malgrado la patologia sia largamente studiata, gli attuali metodi d’indagine non permettono una totale comprensione dei complessi meccanismi acantolitici. Studi recenti hanno dimostrato che nel siero dei pazienti vi sono combinazioni variabili di autoanticorpi contro numerose molecole di superficie dei cheratinociti, come quelli contro i recettori dell’acetilcolina. Ogni combinazione porta all’insorgenza di fenotipi patologici differenti con diversa risposta alle terapie. Da poco è stato creato un modello attivo di pemfigo mediante il trasferimento adottivo di splenociti da topi immunizzati con la Dsg3 ricombinante in topi immunodeficienti Rag2-/-. Questo nuovo modello sviluppa spontaneamente bolle ed erosioni cutanee ma senza riprodurre la patologia nella sua complessità. Al fine di promuovere la creazione di un modello animale più completo, il mio lavoro di tesi si è incentrato sulla generazione delle proteine ricombinanti murine corrispondenti agli autoantigeni maggiori e minori degli autoanticorpi del pemfigo, come descritto da Kalantari-Dehaghi et al, 2013, e Chernyavsky et al, 2008. Utilizzando il Baculovirus Expression Vector System sono stati ottenuti i baculovirus ricombinanti esprimenti le porzioni extracellulari di: Dsg3, Dsg1, Desmocollina 3, subunità α7 e α9 del recettore nicotinico dell’acetilcolina e subunità M3 del recettore muscarinico dell’acetilcolina. Con stock baculovirali ad alto titolo si è potuto infettare le cellule d’insetto Sf9 per la produzione di ciascuna proteina ricombinante. Dopo la fase di ottimizzazione dell'espressione e della produzione proteica, è stato anche perfezionato il protocollo di purificazione delle singole proteine ricombinanti. Sfruttando il Tag di istidine apposto all’estremità C-terminale delle proteine da noi prodotte è stato possibile utilizzare l’Immobilised Metal ion Affinity Chromatography per ottenere campioni di Dsg3 e Dsg1 puri. Le proteine ricombinanti ottenute saranno in seguito utilizzate per immunizzare topi KO condizionali, e mediante il protocollo di trasferimento adottivo degli splenociti in topi Rag2-/- sarà possibile ottenere modelli attivi di pemfigo esprimenti combinazioni diverse di autoanticorpi. Questi modelli saranno utili per identificare nuove pathways patologiche e per definire i trattamenti più efficaci per le diverse forme di pemfigo.
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