Riassunto analitico
La Timidilato sintasi umana (hTS), un target fondamentale nella chemioterapia, catalizza la conversione di 2'-deossiuridina-5'-monofosfato in 2'-deossitimidina-5'-monofosfato. Mentre questa attività catalitica è specifica dell'omodimero, il monomero di hTS può legarsi al suo mRNA, controllando così i livelli di espressione dell'enzima reprimendo sua efficienza traduzionale. È stato suggerito che questo meccanismo di autoregolazione possa essere alla base del problema clinico di farmaco-resistenza che insorge nella chemioterapia del cancro ovarico; infatti classici inibitori hTS impiegati in protocolli clinici che legano la tasca catalitica stabilizzano la forma dimerica di hTS, riducendo la capacità dei monomeri di interagire con mRNA di hTS, con conseguente sovraespressione hTS. Per questo motivo, inibitori allosterici hTS capaci di inibire l'attività catalitica senza ostacolare la funzione autoregolatoria, sono un nuovo indirizzo di ricerca. Il mio lavoro di tesi è stato eseguito nell'ambito di un progetto di ricerca che mira ad identificare molecole in grado di legarsi all'interfaccia monomero / monomero di hTS e quindi destabilizzare la forma dimerica e inibire la sua attività catalitica, pur mantenendo la sua facoltà autoregolatoria. Per fare ciò è stato progettato una strategia multidisciplinare complessa (la strategia 'tethering'), che comprende diversi tools di ricerca come structure-based virtual screening (SBVS), ingegneria proteica, diffrazione di raggi X e la spettrometria di massa. Con esso si è arrivati alla selezione del residuo hot spot Y202 come sito di legame per librerie di composti da screenare per la loro capacità di legarsi nella tasca posta all'interfaccia monomero/monomero. Lo scaffold ottenuto è stato poi migliorato con metodi computazionali nella direzione di un composto lead-like. Da qui sono stati ottenuti una serie di composti che sono stati testati con un medium-throughput screening basato sull'efficienza di FRET. Il saggio mira a determinare la loro capacità di provocare una diminuzione della efficienza del trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET) tra donatore e accettore legati alle subunità monomeriche di hTS. Questa efficienza è unitaria nel dimero HTS e nulla nei monomeri dissociati. Pertanto, questo saggio permette di monitorare la frazione di dimero presente: composti in grado di causare una riduzione dell'efficienza FRET favoriscono la dissociazione della proteina. Tra i composti testati, tre sono stati selezionati per essere simultaneamente attivi nel diminuire l'efficienza di FRET e l'attività catalitica hTS. Questi sono stati poi soggetto di ulteriori indagini per verificare il loro meccanismo d'azione: obiettivo di questa tesi. Per raggiungere lo scopo sono state utilizzate in combinazione tecniche computazionali e sperimentali. Nel primo caso, software come Autodock (per eseguire i calcoli di docking), Discovery Studio (per il disegno e la progettazione dei composti studiati) e Gromacs (per l'esecuzione di simulazioni di dinamica molecolare). Nel secondo tecniche spettroscopiche, come il saggio FRET descritto prima per la determinazione dell'attività dissociativa dei composti in esame sulla proteina target. L'analisi dei risultati conferma che questi composti sono in grado di legarsi all' interfaccia monomero-monomero e determinando la dissociazione del dimero. Essi rappresentano il primo esempio di inibitori dissociativi di hTS e la base per lo sviluppo di nuovi agenti terapeutici in grado di inibire l'attività catalitica della hTS senza compromettere la sua funzione autoregolatoria.
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Abstract
Human thymidylate synthase (hTS), a critical target in cancer chemotherapy, catalyzes the conversion of 2’-deoxyuridine-5’-monophosphate into 2’-deoxythymidine-5’-monophosphate. While this catalytic activity is specific of the homodimer, the monomers of hTS can bind to its mRNA, thereby controlling the levels of enzyme expression by repressing its translational efficiency. It has been suggested that this self-regulatory mechanism may lie at the basis of the clinically severe problem of drug-resistance onset in ovarian cancer chemotherapy: because classical hTS inhibitors employed in clinical protocols target the catalytic pocket, it has been postulated that they might stabilize the dimeric form of hTS, thus depleting the ability of the monomers to regulate hTS-mRNA translation and eventually resulting in hTS overexpression. For this reason, hTS allosteric inhibitors able to inhibit the catalytic activity without hampering the self-regulatory function, are actively search for. My thesis work has been performed within a research project that aims at identifying compounds able to bind at the hTS monomer/monomer interface and thereby destabilize the dimeric form and inhibit its catalytic activity, while maintaining its regulatory efficiency.
A complex multidisciplinary approach (the ‘tethering’ strategy), that comprised various investigational tools, such as structure-based virtual screenings, protein engineering, X-ray diffraction and mass spectrometry, was adopted. It enabled the selection of the hot spot residue Y202 as the binding site for libraries of compounds to screen their affinity for the pocket of the monomer/monomer interface region where it lies. The chemical scaffold thus obtained has been later improved by computational methods in the direction of a lead-like compound. This approach has provided a series of compounds that have been tested with a medium-throughput FRET-based assay. The assay aimed at screening these compounds for their ability to cause a decrease in the efficiency of fluorescence resonance energy transfer (FRET) between a donor and an acceptor bound to the hTS monomeric subunits. This efficiency was unit in the hTS dimer and null between dissociated monomers. Therefore, its monitoring provided a measure of the dimer fraction: compounds able to cause a decrease in FRET efficiency likely favored dissociation of protein dimers to monomers.
Among the tested compounds, three were found to be consistent in decreasing the FRET efficiency while inhibiting the hTS catalytic activity. They were then further investigated to verify their mechanism of action which is the objective of this thesis.
The work included the combination of both the computational and experimental techniques. In the former, softwares such as Autodock (for performing docking calculations), Discovery Studio (for designing the studied compounds) and Gromacs (for performing molecular dynamics simulations) were used while the experimental techniques involved spectroscopy based analysis. For this analysis, quantitative fluorescence-based assay have been used in order to support the proposed mechanism, held accountable for their inhibitory activity vs hTS. It has been found that these compounds do bind at the targeted inter-monomer pocket and shift the dimer-monomer equilibrium towards the latter, inactive form, therefore acting as dissociative inhibitors. They represent the first example of this kind of inhibitors of hTS.
These results represent the basis for the development of new therapeutic agents able to inhibit the catalytic activity of hTS without affecting its self-regulatory function.
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