Riassunto analitico
Il mio progetto di tesi riguarda lo sviluppo e caratterizzazione di un dispositivo per la stimolazione meccanica biassiale (di seguito denominato stretcher) di cellule compatibile con la loro osservazione in microscopia ottica.
Il dispositivo si basa sull’utilizzo di motori passo-passo controllati da un sistema Arduino e un programma in Python dedicato che permettono di applicare a cellule cresciute su un substrato elastomerico deformazioni in due direzioni perpendicolari mantenendo contemporaneamente condizioni ottimali per le colture cellulari (37°C, 99% umidità relativa e 5% CO2).
Lo stretcher fornisce la possibilità di studiare il comportamento delle cellule quando queste vengono sottoposte a deformazioni meccaniche periodiche riproducendo così situazioni fisiologicamente rilevanti quali le deformazioni periodiche nel tessuto cardiaco e nel sistema vascolare. In particolare, le cellule reagiscono alla stimolazione meccanica orientando le proprie strutture citoscheletriche in modo da raggiungere una situazione omeostatica dal punto di vista meccanico. Alterazioni della normale deformazione del tessuto dovute a situazioni patologiche possono portare le cellule ad una reazione in cui la loro espressione genica è profondamente alterata e possono indurre una reazione fibrotica.
Lo stretcher sviluppato e utilizzato in questo lavoro di tesi permette di modificare la direzione di deformazione in modo arbitrario e si presta quindi a studi che simulino la produzione di danni tissutali. Lo strumento permette inoltre di verificare le teorie analitiche relative al raggiungimento dell’omeostasi meccanica da parte delle cellule. Allo stesso tempo permette di effettuare l’osservazione e l’acquisizione di immagini attraverso un microscopio ottico invertito per seguire il comportamento delle cellule nel tempo al variare dello stimolo applicato.
Le proprietà di deformazione del dispositivo sono state caratterizzate mediante una taratura diretta ed una simulazione meccanica con software per l’analisi ad elementi finiti.
Sono stati effettuati diversi esperimenti. In tali esperimenti in un primo momento viene applicato a fibroblasti cardiaci (HCF, Human Cardiac Fibroblasts) uno stretching periodico lungo un asse, permettendo così alle cellule di orientarsi lungo le direzioni di minima deformazione e successivamente, la direzione di stretching viene invertita, in modo da poter osservare il riorientazione delle cellule.
L’osservazione in tempo reale e l’acquisizione dati coprono un arco di tempo di diverse ore, grazie all’utilizzo di un sistema di autofocus dedicato controllato da uno specifico codice Python.
Lo studio dell’orientazione delle cellule prima e dopo l’inversione della direzione di stretching ha permesso di identificare le due direzioni di minima deformazione in entrambe le configurazioni di stretching e di caratterizzare la cinetica di riorientazione delle cellule. La dipendenza della cinetica di riorientazione dalla frequenza di stretching è stata evidenziata.
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Abstract
My thesis project deals with the development and characterization of a biaxial cell stretching device (hereafter called stretcher) compatible with time-lapse optical imaging.
The device exploits four stepper motors controlled by an Arduino-based system and a custom-made Python script providing stretching in two perpendicular directions to cells grown on an elastomeric substrate while keeping optimal conditions for cell cultures (37°C, 99% RH and 5% CO2 atmosphere).
The stretcher provides the possibility to study cells behaviour when they are subjected to periodic mechanical deformations, reproducing physiologically relevant situations involving periodic stimuli, as it occurs in the cardiac tissue and vascular system.
In particular, cells react to mechanic stimulation by reorienting their cytoskeletal structures in such a way to reach a homeostatic situation from a mechanical point of view. Alterations of the normal tissue deformation due to pathological conditions can lead cells to a reaction in which their genetic expression is deeply altered, inducing a fibrotic reaction.
The stretcher developed and used in this thesis project allows to arbitrarily modify the deformation direction, so it is therefore suitable to studies that simulate tissue damages production. Moreover, the device allows to verify analytical theories related to the achievement of mechanical homeostasis by cells.
In addition, the stretcher allows the observation and image acquisition by an inverted optical microscope, following changes in cells behaviour in time according to the varying stimuli.
The device deformation properties were characterized by both a direct calibration and mechanical FEM simulations with a specific software.
Several experiments were then performed. In these experiments, at first, fibroblasts (HCF, Human Cardiac Fibroblasts) were stretched with a periodic cyclic stimulus applied in one direction and allowed to orient themselves along the minimum strain directions. Afterwards, the stretch direction was switched to the perpendicular one, and cells reorientation was observed.
Live-imaging and data acquisition were carried out for several hours thanks to a dedicated autofocus system, controlled by Arduino and a specific Python script.
The study of cells orientation before and after the stretching direction inversion allowed to identify the two minimum strain directions in both stretching configurations and to characterize the kinetics of cells reorientation. The dependence of the reorientation kinetics on the stretching frequency has been highlighted.
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