Riassunto analitico
La presente tesi sperimentale di laurea magistrale, svolta presso la University of Pardubice, Department of Analytical Chemistry, sotto la supervisione scientifica del Prof. Petr Cesla nell’ambito del programma Erasmus+ (coordinatore Prof. Federica Pellati), è stata focalizzata sullo sviluppo di un metodo HPLC per l’analisi di undici benzodiazepine di sintesi (pyrazolam, nifoxipam, flubromazepam, flubromazolam, desclorazolam, nimetazepam, fenazepam, etizolam, meclonazepam, bentazepam and diclazepam) utilizzando un detector UV. Durante il lavoro sono stati ottimizzati tutti i processi e gli aspetti dell’analisi HPLC per avere una completa separazione delle benzodiazepine oggetto di indagine. Inizialmente, è stata ottimizzata la composizione dalla fase mobile, costituita da un tampone fosfato (preparato da una soluzione di Na2HPO4 10 mM che è stata aggiunta ad una soluzione di NaH2PO4 10 mM fino al raggiungimento di un pH 7) ed acetonitrile a diverse percentuali ed a diversi gradienti. Ci si è quindi indirizzati alla scelta della fase stazionaria, eseguendo prove con una colonna C18, fase stazionaria idrofobica usata quando c’è grande differenza nella polarità degli analiti, spostandosi poi su una colonna fenilica, che invece interagisce fortemente con gli analiti contenenti un sistema elettronico (aromatici, insaturi), e che trattiene specificatamente questi composti; nello specifico è stata utilizzata una colonna feniletilica. Si è inoltre valutata la concentrazione del campione, partendo da soluzioni diluite fino a quelle più concentrate, in diversi solventi, al fine di avere una migliore definizione dei picchi e determinazione dei campioni. Infine, ci si è rivolti alla ottimizzazione del flusso della fase mobile e del tempo di analisi. Al fine di identificare i composti, sono state condotte analisi anche sulle singole benzodiazepine oggetto di studio. Abbiamo basato il nostro lavoro sulla letteratura scientifica sulle benzodiazepine e sulla separazione in HPLC, in base a questa ed alle evidenze empiriche possiamo affermare di aver definito una procedura per la determinazione in HPLC di benzodiazepine sintetiche.
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Abstract
This thesis work, carried out at the University of Pardubice, Department of Analytical Chemistry under the supervision of Prof. Petr Cesla in the ambit of the Erasmus+ program (coordinator Prof. Federica Pellati), is focused on the development of a HPLC method for separation of eleven designer benzodiazepines (pyrazolam, nifoxipam, flubromazepam, flubromazolam, deschlorazolam, nimetazepam, phenazepam, etizolam, meclonazepam, bentazepam and diclazepam) using an UV detector. During this work we optimized various aspects of the HPLC separation in order to have a complete separation of the target benzodiazepines. We started from the mobile phase, with a mixture of phosphate buffer (made by adding a solution of Na2HPO4 10 mM to a solution of NaH2PO4 10 mM until the achievement of pH 7) and acetonitrile at different percentage and some different gradients to have a certain optimization. We worked also on the stationary phase, testing first a C18 column, a hydrophobic stationary phase used when differences in analyte hydrophobicity are large and can be exploited to affect a separation, than moving to a phenyl-containing phase, that interacts strongly with analytes containing -electron systems (aromatic, unsaturated) and retain these analytes in preference, specifically a phenyl-hexyl column. We worked also on the sample concentration in different solvents, starting with a low concentration to a high one, in order to have a better definition of peaks and determination of the samples. At last we made some tests to have a separation optimization, working on the time of separation and the flow rate. We analyzed also all the single compounds, one by one at the same condition, to recognize which peak belongs to which compound into the graphic transposition. We based our work on the scientific literature about benzodiazepines and their separation in HPLC, so because of that and because of the empirical evidences we can say that we have defined a proper procedure for determination of designer benzodiazepine in HPLC.
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