Riassunto analitico
Nel Global Tuberculosis Report 2018, l'Organizzazione Mondiale della Sanità ha dichiarato che "millions of people continue to fall sick with tuberculosis every year and drug-resistant tuberculosis continues to be a public health crisis". La tubercolosi (TB) è causata dal Mycobacterium tuberculosis, il quale sopravvive all'interno dei macrofagi alveolari (AM). Considerando che il 75-80% dei casi di infezione rimane localizzato nei polmoni, la terapia di maggior successo coinvolgerebbe la via di somministrazione inalatoria, più efficace rispetto al trattamento convenzionale (che prevede una somministrazione orale o intramuscolare) offrendo benefici in termini di autonomia e compliance del paziente, evitando il metabolismo di primo passaggio, permettendo la riduzione della dose, frequenza di somministrazione e durata del trattamento, minimizzando così il rischio di mutazioni alla base della farmaco-resistenza, di tossicità ed effetti collaterali. Nelle precedenti ricerche già pubblicate sono state sviluppate Solid Lipid Nanoparticle assemblies (SLNas) respirabili quali carrier di rifampicina (RIF), mediante l’impiego di taurocolato di sodio (ST) come tensioattivo e tecnica di emulsione a caldo seguita da liofilizzazione. Con lo scopo di ottenere un targeting attivo del carrier verso i recettori del mannosio (MR) macrofagici, sovraespressi sulla membrana di macrofagi alveolari infetti, la superficie delle SLNas è stata funzionalizzata senza reazioni chimiche utilizzando metil α-D-mannopiranoside in una miscela con ST. Tuttavia, la mannosilazione ha determinato una riduzione della respirabilità a causa di un’aumentata sensibilità all’umidità e coesione tra le nanoparticelle. Pertanto, sono stati sintetizzati nuovi derivati anfifilici del mannosio capaci di ancorarsi più stabilmente sulla superficie delle SLNas (brevetto depositato) e di evitare l’utilizzo di ST come co-tensioattivo, ottenendo buoni livelli di respirabilità e di uptake da parte dei macrofagi. Sulla base di tali risultati, la presente ricerca si è focalizzata, inizialmente, sulla dimostrazione del coinvolgimento del legame specifico tra MR di macrofagi J774 e SLNas. Sono state poi sviluppate nuove SLNas funzionalizzate combinando due nuovi derivati del mannosio con ST, noto promotore dell'uptake macrofagico e potenzialmente in grado di riconoscere il dominio N-terminale sui MR. In seguito alla caratterizzazione delle proprietà intrinseche delle nanoparticelle (dimensioni, morfologia, carica superficiale, densità, diametro aerodinamico, stato fisico dei componenti, caricamento e rilascio del farmaco in vitro), è stata studiata la performance respiratoria, mediante Glass Twin Impinger e Next Generation Impactor, e sono state valutate le proprietà di superficie tramite analisi EDX, XPS e di bagnabilità. Inoltre, è stata esaminata l’eventuale interazione tra un tensioattivo polmonare commerciale naturale, contenente proteine e fosfolipidi, e le SLNas e la conseguente formazione di uno strato proteico/lipidico (protein corona). Il dimostrato coinvolgimento di un legame specifico tra le SLNas e i MR ha determinato un aumento del 40% della concentrazione intramacrofagica di RIF rispetto a cellule macrofagiche caratterizzate da MR previamente saturati. Il processo di funzionalizzazione delle SLNas ha prodotto una polvere scarsamente coesiva con un'adeguata respirabilità (40-50% di frazione respirabile). Inoltre, le analisi eseguite in presenza del tensioattivo polmonare hanno permesso di dedurre la formazione del protein corona sulla superficie delle SLNas riconoscendone la capacità di influenzare il rilascio in vitro del farmaco. Sono attualmente in corso studi di internalizzazione su linea cellulare di macrofagi alveolari e, in collaborazione con il Laboratorio di Tecnologia Farmaceutica dell'Università Federale di Goiás (Brasile), studi in vivo su modelli animali di targeting e biodistribuzione delle SLNas funzionalizzate.
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Abstract
In the Global Tuberculosis Report 2018, the World Health Organization declared that “millions of people continue to fall sick with tuberculosis every year and drug-resistant tuberculosis continues to be a public health crisis”. Tuberculosis (TB) is caused by Mycobacterium tuberculosis surviving inside alveolar macrophages (AM). Considering that 75-80% of cases of infection remain localized in the lungs, the easiest and most successful therapy would involve the inhalation route. An inhaled drug delivery to AM would be more effective compared with the conventional treatment (that involves oral and intramuscular administration) offering benefits in terms of patient’s autonomy and compliance, by-passing hepatic metabolism, reducing dose amount, dose frequency, and treatment duration, thus minimising the risk of drug-resistant mutants, toxicity, and side effects.
Previous published researches developed respirable nanoparticle carrier prototypes, named Solid Lipid Nanoparticle assemblies (SLNas), loaded with an anti-TB drug, Rifampicin (RIF), using biocompatible materials and sodium taurocholate (ST) as the surfactant, via melt emulsifying and optimized freeze-drying techniques. With the purpose to attain an active targeting towards AM bearing mannose receptors (MR), overexpressed on infected cells, SLNas surface was functionalized by a novel technique avoiding chemical reactions using methyl α-D-mannopyranoside in a blend with ST. Nevertheless, mannosylation determined a reduction in respirability, probably owing to moisture adsorption on mannose residues and high adhesion forces among mannose hydroxyl groups leading to powder cohesiveness. Novel more balanced amphiphilic mannose derivatives with a possible different anchoring on SLNas surface were therefore synthesized (patent filed) and used in absence of ST as the co-surfactant reaching satisfying respirability and macrophage uptake.
On the basis of these previous results, the present research has focused initially on the demonstration of the actual involvement of MR specific binding between macrophage cells J774 and SLNas. Subsequently, novel surface decorated SLNas were developed by combining two newly synthesized mannose derivatives with ST known to be an enhancer of macrophage uptake as well as supposed to be a compound able to recognize the N-terminal domain on MR. Following a physico-chemical characterization of particle intrinsic properties (size, morphology and shape, surface charge, bulk and tap density, aerodynamic diameter, physical state of the components, drug loading, and in vitro drug release), SLNas respirability performance and surface properties were investigated by Glass Twin Impinger as well as Next Generation Impactor and by Energy Dispersive X-ray, X-ray Photoelectron Spectroscopy, and wettability, respectively. Furthermore, possible interactions between the lung lining fluid, containing proteins and phospholipids, and SLNas generating a layer around the particles were assessed by means of a set of analyses using a commercial natural lung surfactant.
The involvement of MR specific binding has been demonstrated causing an increase of RIF intramacrophagic concentration of about 40% compared with macrophages bearing saturated MR. The established surface-decoration of SLNas produced a poor cohesive powder with an adequate respirability (fine particle fraction ranging from about 40% to 50%). Moreover, nanoparticles were capable of forming a protein/lipid layer (called protein corona) on their surface affecting in vitro drug release. Studies concerning SLNas uptake by alveolar macrophage cell line as well as in vivo drug targeting and biodistribution on animal models in collaboration with the Laboratory of Pharmaceutical Technology at the Federal University of Goiás (Brazil) are ongoing.
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