Riassunto analitico
La terapia genica ex-vivo (GT) è un promettente trattamento curativo per diverse malattie genetiche ereditarie, basato sul trapianto autologo di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC) che vengono geneticamente corrette mediante trasduzione lentivirale.
Le condizioni ottimali di trasduzione delle HSPCs devono determinare un elevato livello di correzione genica e, allo stesso tempo, preservare l’omeostasi e il potenziale di ripopolamento delle cellule staminali dopo la manipolazione in vitro.
Nel contesto dello sviluppo di un protocollo di terapia genica, sicuro ed efficace, sono stati testati gli effetti in vitro della Prostaglandina E2 (PGE2), già nota in letteratura come potenziatore dell’efficienza di trasduzione in HSPCs.
Sono state trasdotte, con vettori lentivirali auto-inattivanti, cellule CD34+, mobilizzate dal sangue periferico di donatori adulti sani, con PGE2 o in condizioni standard, cioè senza PGE2.
Sono stati valutati le conseguenze della PGE2, sia in vitro che in vivo, per quanto concerne il potenziale clonogenico, la composizione delle HSPC e il profilo di integrazione lentivirale.
In particolare, questo progetto di tesi si è focalizzato sull'analisi comparativa del profilo di integrazione e dei geni bersaglio del vettore lentivirale in cellule mieloidi derivate da cellule CD34+ mobilizzate dal sangue periferico e nella progenie delle HSPC trasdotte dopo xenotrapianto competitivo in topi NBSGW immunodeficienti (NOD B6. SCID Il2rγ-/- KitW41/W41).
Dato che il profilo di integrazione dei vettori lentivirali nelle cellule staminali ematopoietiche umane è molto ben caratterizzato, lo scopo di questo progetto è stato di valutarne un eventuale alterazione dovuta all’uso della PGE2 come potenziatore della trasduzione.
Abbiamo determinato i) il profilo dei siti di integrazione del vettore lentivirale (IS), ii) i geni target e iii) l'ontologia genetica dei geni target nella progenie in vitro e in vivo delle cellule CD34+ trasdotte con o senza PGE2.
Dai risultati ottenuti è emerso che la trasduzione delle cellule CD34+ in presenza di PGE2 determina la normale distribuzione dei siti di integrazione, i geni e le famiglie geniche targhettate sono quelle attese e non è stato evidenziato nessun segno di dominanza clonale in vivo.
Questi dati supportano l'assenza di un aumento del rischio genotossico correlato all'uso di PGE2 come potenziatore della trasduzione negli HSPC CD34+ umani.
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Abstract
Ex-vivo gene therapy (GT), based on the autologous transplantation of genetically corrected Hematopoietic Stem/Progenitor Cells (HSPCs) by lentiviral transduction, is a promising curative treatment for several inherited genetic diseases.
Ideal transduction conditions should determine high gene marking in long-term self-renewing Hematopoietic Stem/Progenitor Cells (HSPCs), preserving their homeostasis and repopulation potential during in vitro manipulation.
In the context of the development of a clinically applicable transduction protocol for GT applications, we tested the effects of Prostaglandin E2 (PGE2) in vitro as a transduction enhancer in human HSPCs. We transduced CD34+ cells derived from mobilized peripheral blood (mPB) of adult healthy donors with self-inactivating lentiviral vectors in the presence of PGE2 or in standard conditions, i.e. without PGE2.
Overall, we investigated the effects of PGE2 in vitro and in vivo on cell clonogenic potential, HSPC composition and lentiviral integration pattern.
In particular, my thesis’ project focused on the comparative analysis of LV integration pattern and target genes in mPB CD34+-derived myeloid cells, and in the progeny of the transduced HSPCs after competitive xenotransplantation in immunodeficient NBSGW (NOD B6. SCID Il2rγ-/- KitW41/W41) mice.
The aim of the project was the investigation of a potential alteration of the well-established integration characteristics of LVs in human HSPCs by PGE2 as transduction enhancer. We determined i) the LV integration sites (ISs) profile, ii) the LV target genes and iii) the gene ontology of the target gene sets in the in vitro and in vivo progeny of the CD34+ cells transduced with or without PGE2.
As a result, transduction of mPB CD34+ cells with PGE2 determines the usual LV IS distribution, the targeting of the expected genes and gene families, and no signs of altered clonal dominance in vivo. These data support the absence of an increased genotoxic risk related to the usage of PGE2 as transduction enhancer in human mPB CD34+ HSPCs.
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