• dif. monocitario
• LMA
• miR130a
• miRNA
• tp anti-tumorali

Introduzione. La Leucemia Mieloide Acuta (LMA) è una neoplasia che riguarda la linea mieloide del sangue, con discreta incidenza a livello mondiale (4,3 casi su 100.000 l’anno) e sopravvivenza a 5 anni pari al 24%. Essa costituisce il 62% dei morti totali per leucemia. I microRNA o miRNA sono invece delle piccole molecole endogene di RNA non codificante, con ruolo attivo nella regolazione genica e nell’induzione al differenziamento di popolazioni cellulari.
Scopo del lavoro. Si è indagata la possibilità di indurre il differenziamento delle cellule tumorali presenti nella LMA sfruttando il miR-130a, un sottotipo di miRNA, introducendo queste molecole all’interno delle cellule con l’utilizzo della trasfezione.
Materiali e metodi. Lo studio è stato condotto secondo le linee guida stabilite dalla delibera della Commissione Etica per la sperimentazione umana di Modena, approvate in data 18 gennaio 2005 con numero 793/CE. Dopo aver prelevato cellule CD34+ da sangue cordonale ombelicale di soggetti sani, queste sono state sottoposte a separazione immunomagnetica e coltivate con aggiunta di una serie di fattori di crescita. Tali cellule sono state poi sottoposte a trasfezione con miRNA osservando gli effetti biologici conseguentemente determinati e analizzando i campioni cellulari mediante QRT-PCR (con il sistema di riconoscimento sequenze ABI PRISM 7900 e l’High Capacity cDNA Archive Kit), saggio clonogenico in metilcellulosa (su piastra MethoCult GF H4434) e analisi di Western blot (con il citofluorimetro Coulter Epics XL-MCL), morfologica ed immunofenotipica.
Risultati. La QRT-PCR ha permesso di valutare l’espressione di miR-130a in cellule staminali ematopoietiche (HSCs), mieloblasti, monoblasti, granulociti e monociti dimostrando che, fra le varie transizioni differenziative analizzate, risulta up-regolata nei mieloblasti e down-regolata negli altri tipi cellulari analizzati.
Si è poi confrontata l'espressione di miR-130a in monoblasti e mieloblasti, per verificare la down-regolazione osservata nel primo fra questi due tipi cellulari e infine si è studiato come i livelli di espressione del miR-130a si modifichino nelle HSCs a seguito del trattamento con un inducente del differenziamento monocitario come la Vitamina D3, evidenziando che miR-130a è down-regolato nelle cellule differenziate rispetto a quelle indifferenziate.
Poiché miR-130a è iper-espresso nella LMA, si è quindi analizzata l'efficacia di un PNA (acido peptido-nucleico) che ha come bersaglio questo microRNA, per valutarne l’efficacia nell'inibire la sua espressione e l’effetto eventualmente promosso sul differenziamento ematopoietico. Il risultato ottenuto è stato che la sovra-regolazione di fattori di trascrizione monocitari si verifica solo nelle HSCs trattate con tale PNA. Inoltre, le cellule in cui miR-130a è stato silenziato dal trattamento con il PNA, hanno mostrato una maggiore positività al marcatore monocito - specifico CD163, come apparso dall'analisi citofluorimetrica.

Conclusioni. I dati ottenuti suggeriscono che una dis-regolazione del miR-130a potrebbe contribuire alla monocitopoiesi aberrante (uno dei meccanismi che portano alla sindrome mielodisplastica e quindi alla LMA). Agendo sull'espressione di miR-130a si potrebbe probabilmente indurre il differenziamento dei monociti, influenzandoli quindi dal punto di vista biologico.
La modulazione dell'espressione di miR-130a, perciò, è necessaria ai fini di un corretto differenziamento mieloide, e getta le basi per un possibile uso futuro di un PNA anti-miR130a come agente terapeutico per ripristinare una corretta espressione genica in tumori maligni ematologici come la LMA. L’ipotesi sembra inoltre supportata dall'osservazione che il trattamento con anti-miR-130a è in grado di indurre l'espressione del fattore trascrizionale MAFB, ovvero il principale regolatore del differenziamento monocitario, suggerendo la sua efficacia in sottotipi specifici della malattia.

Introduction. Acute Myeloid Leukemia (AML) is a cancer that affects the myeloid blood line, with a fair incidence worldwide (4.3 cases per 100,000 per year) and a 5-year survival of 24%. It constitutes the 62% of total deaths from leukemia. MicroRNAs or miRNAs are small endogenous molecules of non-coding RNA, with an active role in gene regulation and in the differentiation of cell populations. Aim of the study. The possibility of inducing differentiation of tumor cells present in AML by exploiting miR-130a, a subtype of miRNA, using the transfection of these molecules within the cells was investigated. Materials and methods. The study has been carried out according to the guidelines established by the Ethics Commission for human experimentation in Modena, approved on 18 January 2005 with number 793/EC. After their recovery, CD34+ cells from umbilical cord blood of healthy subjects were subjected to immunomagnetic separation and then cultured with the addition of a number of growth factors. Once purified, miRNAs have been transfected into these cells observing its biological effects and analysing cell samples through QRT-PCR (with the sequence recognition system ABI PRISM 7900 and the High Capacity cDNA Archive Kit), clonogenic assay in methylcellulose (on plate Methocult GF H4434), Western blot analysis (with the Coulter Epics XL-MCL cytometer), morphological evaluation and immune-phenotypic assessment. Results. QRT-PCR allowed us to evaluate the expression of miR-130a in hematopoietic stem cells (HSCs), myeloblasts, monoblasts, granulocytes and monocytes observing that, during the various considered differentiation transitions, it appears up-regulated in myeloblasts and down-regulated in all other analysed cell types. A similar comparative study was then carried out to confirm our preliminary observation in monoblasts and myeloblasts and then variations of miR-130a expression levels were analyzed in HSCs before and after treatment with an inducer of monocyte differentiation such as Vitamin D3, demonstrating that miR-130a is down-regulated in differentiated cells as compared to undifferentiated ones. Since the expression miR-130a is over-expressed in AML, we finally tested the efficacy of a peptide - nucleic acid (PNA) specifically targeting this microRNA, to assess its capacity to inhibit miR-130a expression and the effects thereby elicited on haematopoietic cell differentiation. The results obtained showed that the up-regulation of transcription factors promoting monocyte differentiation exclusively occurs in HSCs treated with the PNA under consideration. In addition, cells undergoing this treatment exhibited a higher positivity to the CD163 monocyte specific differentiation marker, as shown by flow cytometry analysis. Conclusions. The data obtained suggest that the dys-regulation of miR-130a could contribute to aberrant monocytopoiesis (one of the mechanisms leading to myelodysplastic syndrome and therefore to AML). Acting on the expression of mir-130a it would be therefore possible to induce the differentiation of monocytes and thus to influence them from a biological point of view. Modulation of the miR-130a expression, therefore, is necessary for a proper myeloid differentiation, laying the basis for a possible future use of a PNA anti-miR130a as a therapeutic agent to restore proper gene expression in hematologic malignant tumors such as AML. The hypothesis is also supported by the observation that anti-miR-130a treatment can induce the expression of the MAFB transcription factor, i.e. the master regulation of monocyte differentiation, suggesting its efficacy in specific subtypes of the considered disease.