• Macrophages
• Mannose-Derivatives
• Rifampicin
• SLM
• Tuberculosis

La tubercolosi (TBC), patologia infettiva causata dal Mycobacterium tuberculosis (Mtb), colpisce principalmente i polmoni, ed in particolare i macrofagi alveolari (AM). La terapia convenzionale prevede la somministrazione di farmaci per via orale o per via intramuscolare.
La via polmonare risulta però il metodo più logico ed efficace per indirizzare i farmaci nel sito d’azione, specialmente considerando che il 75-80% dei casi d’infezone rimane localizzata nei polmoni. La terapia anti-TBC per via inalatoria offre vantaggi rispetto al trattamento tradizionale in termini di miglioramento della compliance del paziente, di riduzione della dose e della frequenza della somministrazione, della durata del trattamento e diffusione della patologia in altri organi, minimizzando il rischio d’insorgenza di farmaco resistenze, tossicità ed effetti collaterali.
In un precedente studio, sono state sviluppate Solid Lipid Microparticles (SLM), realizzate con una tecnica di emulsione e solidificazione della fase lipidica seguita da liofilizzazione e caricate con rifampicina, un farmaco antitubercolare di prima linea. Le SLM sono risultate caratterizzate da un appropriato diametro aerodinamico, una scarsa citotossicità e una buona capacità di essere internalizzate in linee cellulari macrofagiche murine J774. Inoltre, per ottenere una polvere respirabile, somministrabile mediante dispositivo Dry Powder Inhaler (DPI), è stato adottato il metodo statistico Design of Experiments (DoE) al fine di ottimizzare le condizioni di liofilizzazione permettendo l’ottenimento di polveri ad elevata respirabilità abbinando condizioni di rapido congelamento e diluizione del campione.
Nel presente studio, SLM prodotte con le teniche ottimizzate precendentemente, sono state modificate per migliorare il livello di caricamento in farmaco, il suo rilascio dal carrier e il targeting ai macrofagi alveolari. Diversi composti lipidici biocompatibili come acidi grassi e loro derivati, digliceridi e trigliceridi sono stati utilizzati per la formulazione dei carrier in combinazione con miscele di stabilizzanti biocompatibili (taurocolato sodico e metil-mannopiranoside). Inoltre, sono stati sviluppati Microstructured Lipid Carriers (MLC) incorporando nelle SLM lipidi allo stato liquido al fine di ottenere un maggiore caricamento e prevenire un rilascio precoce del farmaco, cioè prima del processo di internalizzazione da parte dei macrofagi alveolari. Le microparticelle ottenute sono state analizzate per le loro proprietà intrinseche come dimensione e distribuzione dimensionale, morfologia e forma, carica superficiale, densità al versamento e all’impaccamento, diametro aerodinamico, stato fisico dei componenti, bagnabilità, caricamento e rilascio del farmaco.
I macrofagi, come è noto, possiedono specifici recettori di membrana denominati recettori del mannosio (MR) che, riconoscendo residui di mannosio sulle particelle, possono facilitarne la loro internalizzazione. Pertanto, la ricerca ha avuto come obiettivo la funzionalizzazione superficiale delle SLM con derivati del mannosio utilizzati come co-stabilizzanti con l’obiettivo di ottenere un targeting attivo ai macrofagi alveolari. La presenza effettiva delle molecole di mannosio sulla superficie delle SLM è stata esaminata mediante Electron Spectroscopy for Chemical Analysis (ESCA), assorbimento superficiale di Rosa Bengala e Energy Dispersive X-ray Analysis (EDX).

Human tuberculosis (TB) is mainly a disease of the lung characterised by a long chronic stage of infection and progressive pathology that compromise the respiratory system. This is a curable infectious bacterial disease caused by the Mycobacterium tuberculosis (Mtb). TB therapies have exploited conventional routes of administration, such as oral and intramuscular. The pulmonary route appears the most reasonable and effective way to target the alveolar macrophages (AM) and eradicate surviving Mtb at the primary infected site of TB, especially considering that 75-80% of cases remain localised in the lungs. The anti-TB therapy by inhalation offers benefits compared with the current treatment in terms of patient’s compliance improvement, reduction in dose amount and frequency, treatment duration and TB diffusion in other organs, thus minimising the risk of drug-resistant mutants, toxicity and side effects. In a previous research, for a direct intramacrophagic antitubercular therapy using Dry Powder Inhaler (DPI) devices, Solid Lipid Microparticles (SLM), produced using the melt emulsifying technique followed by freeze-drying, were developed loading rifampicin, a first-line antitubercular drug. The designed SLM were found proper for aerodynamic diameter, poor cytotoxicity and viable cell internalisation ability assayed on murine macrophages J774 cell lines. Moreover, to obtain a respirable SLM powder, a Design of Experiments (DoE) approach was adopted as a statistical tool for optimising the freeze-drying procedure conditions. Effectively, the most favourable impact on the powder respirability was offered by quick-freezing combined with a sample dilution before the freezing step without the use of cryoprotectants. In the present project, the highly respirable SLM loaded with rifampicin were modified to improve drug loading level and release as well as AM targeting. Several biocompatible lipid components such as fatty acids and their derivatives, diglycerides and triglycerides were processed using mixtures of biocompatible stabilisers (sodium taurocholate and methyl mannopyranoside) in order to obtain SLM with maximum efficiency in terms of drug loading and release in simulated lung fluid. Lipids in the liquid physical state embedded into SLM provided Microstructured Lipid Carriers (MLC) that are known to exhibit superior advantages over SLM such as enhanced drug loading capacity and prevention of drug expulsion intended to maximise the drug concentration at the primary site of TB infection. The obtained microcarriers were examined for their intrinsic properties such as size and size distribution, morphology and shape, surface charge, bulk and tap density, aerodynamic diameter, physical state of the components, wettability, drug loading and release. Macrophages, as is common knowledge, possess mannose-specific membrane receptors (MR) that can be recognised by carriers bearing mannose residues, facilitating their internalisation. Therefore, the functionalisation of SLM surface by mannose derivatives used as the co-stabiliser in the SLM formulation was used to achieve an active targeting. The actual presence of mannose on SLM surface was investigated by means of Electron Spectroscopy for Chemical Analysis (ESCA), surface hydrophobicity measured by Rose Bengal adsorption, and Energy Dispersive X-ray Analysis (EDX).