Riassunto analitico
I recettori ionotropici glutamatergici (iGluRs), AMPA, NMDA e KA, sono essenziali per il normale sviluppo neuronale e sono coinvolti in processi fisiologici e patologici (Szczurowska and Mares, 2013).
Gli AMPARs e NMDARs sono i principali responsabili della trasmissione eccitatoria (Dingledine et al., 1999) ed essenziali per la plasticità celebrale (Paoletti et al., 2013).
I KARs mediano la trasmissione sinaptica lenta in specifiche aree celebrali e sono implicati nella modulazione presinaptica del rilascio neurotrasmettitoriale (Sihra and Moreno, 2013).
Disfunzioni dei iGluRs sono responsabili di vari disordini neurologici e psichiatrici, compresi epilessia, schizofrenia e malattie neurodegenerative come Alzheimer (AD) e Parkinson (PD) (Mony et al., 2009).
I iGluRs rappresentano un potenziale target per lo sviluppo di farmaci nootropici, sostanze cioè che potenziano la memoria (Lerma and Marques, 2013).
La ciclotiazide e il diazossido sono stati i primi composti ad essere studiati, ma il loro uso è stato limitato a causa delle scarse proprietà farmacocinetiche (Yamada and Tang, 2003).
Nuovi farmaci sono stati sviluppati, tra cui IDRA21 (7-Cloro-3-metil-3,4-didro-2H-1,2,4-benzotiadiazina1,1-diossido), un derivato benzotiazidico che agisce come modulatore allosterico positivo (PAM), e, attraversando più efficientemente la BEE,che ha effetti nootropici (Bertolino et al., 1993).
E' stata poi sintetizzata una nuova serie di derivati di IDRA21 e il 7-chloro-5-(3-furanil)-3-metil-3,4-didro-2H-1,2,4-benzotiadiazina 1,1-diossido (3FURA) ha dimostrato di essere il composto più promettente (Battisti et al., 2011).
Lo scopo del nostro studio è quello di valutare l'effetto di 3FURA sull'attività dei iGluRs e confrontarlo con quello di IDRA21.
Usando la tecnica del patch clamp, abbiamo studiato l'azione di 3FURA e IDRA21 sulle correnti KA, AMPA e NMDA in neuroni cerebellari e in sistemi eterologhi (cellule HEK trasfettate transientemente con le subunità di KARs e AMPARs e fibroblasti che esprimono stabilmente le subunità NR1A-2A o NR1A-2B dei NMDARs).
In neuroni, IDRA21 e 3FURA potenziano le correnti KA-evocate in maniera dose-dipendente e 3FURA è più potente ed efficace. La co-applicazione di KA e GYKI53655, antagonista non competitivo dei AMPARs, produce una corrente aumentata da IDRA21 e da 3FURA con EC50 rispettivamente di 568+/-276uM e 20+/-4uM. 3FURA è inoltre più efficace di IDRA21.
IDRA21 e 3FURA modulano diversamente i NMDARs: IDRA21, infatti, riduce mentre 3FURA potenzia le correnti NMDA-evocate.
Successivamente, abbiamo valutato se l'effetto di questi due composti fosse subunità-specifico.
In HEK esprimenti le diverse combinazioni delle subunità GluR5, GluR6, KA1 e KA2 dei KARs, 3FURA e IDRA21 potenziano in maniera dose-dipendente le correnti evocate dal glutammato.
3FURA è sempre più potente ed efficace di IDRA21, anche se l'associazione di KA1 e KA2 con GluR5 causa una drastica riduzione della sua potenza. IDRA21 invece mantiene un comportamento simile con tutte le combinazioni testate, ad eccezione di GluR6-KA1/KA2, dove la sua efficacia è più bassa.
In HEK che esprimono le subunità GluRA e GluRB del recettore AMPA, 3FURA è un ordine di grandezza più potente di IDRA21 (EC50RAC~50uM e EC50 IDRA21~500uM).
Infine abbiamo studiato l'effetto di IDRA21 e 3FURA sulle correnti evocate dall'NMDA in fibroblasti che esprimono stabilmente le subunità NR1A-2A o NR1A-2B dell'NMDA.
Visto il promettente profilo farmacologico, 3FURA può rappresentare un nuovo lead per la generazione di composti utili nel trattamento di patologie come schizofrenia e malattie neurodegenerative caratterizzate da alterazioni della funzione dei iGluRs.
Esperimenti futuri in vivo saranno fondamentali per evidenziare gli effetti di 3FURA e derivati e potranno permetterci di capire meglio il meccanismo d'azione di questi PAMs.
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Abstract
Ionotropic glutamate receptors (iGluRs), AMPA, NMDA and KA receptors, are essential for normal neuronal development and are involved in physiological and pathological processes (Szczurowska and Mares, 2013).
AMPARs and NMDARs are the major determinants of the excitatory transmission (Dingledine et al., 1999) and essentials for brain plasticity (Paoletti et al., 2013).
KARs mediate slow synaptic transmission in specific brain areas and are implicated in presynaptic modulation of neurotransmitters release (Sihra and Moreno, 2013).
Dysfunctions of iGluRs are responsible for various neurological and psychiatric disorders, including epilepsy, schizophrenia and neurodegenerative diseases such as Alzheimer (AD) and Parkinson (PD) (Mony et al., 2009).
iGluRs represent a potential target for the development of nootropic drugs, i.e substances that act as cognition and memory enhancers (Lerma and Marquez, 2013).
Cyclothiazide and diazoxide were the first compounds that were studied but their use was precluded by the poor pharmacokinetic properties (Yamada and Tang, 2003).
New drugs were developed, among them IDRA21 (7-Chloro-3-methyl-3,4-dihydro-2H-1,2,4-benzothiadiazine1,1-dioxide), a benzothiazide derivative that acting as positive allosteric modulator (PAM), and being able to cross more efficiently the BBB, has indeed nootropic effects (Bertolino et al., 1993).
A new series of IDRA21 derivatives was synthesized and 7-chloro-5-(3-furanyl)-3-methyl-3,4-dihydro-2H-1,2,4-benzothiadiazine 1,1-dioxide (3FURA) was proved to be the most promising compound (Battisti et al., 2011).
The aim of our study is to evaluate the effect of 3FURA on iGluRs activity and compare its action with that of IDRA21.
By using the patch clamp technique, we study 3FURA and IDRA21 action on KA, AMPA and NMDA currents in cerebellar neurons and in heterologous systems (HEK cells transiently transfected with different subunits of KARs and AMPARs and fibroblasts that stably expressed NR1A-2A or NR1A-2B subunits of NMDARs).
In neurons, IDRA21 and 3FURA potentiate KA-evoked currents in a dose-dependent way and 3FURA is more potent and efficacious. Co-application of KA and GYKI53655, non competitive antagonist of AMPARs, elicites a current that is augmented by both IDRA21 and 3FURA with EC50 of 568+/-276uM and 20+/-4uM, respectively. 3FURA is also more efficacious than IDRA21.
IDRA21 and 3FURA differently modulate NMDARs: IDRA21, in fact, reduces, while 3FURA potentiates NMDA-evoked currents.
Then, we investigate if the effect of these two compounds is subunit-specific.
In HEK expressing the different combinations of GluR5, GluR6, KA1 and KA2 subunits of KARs, 3FURA and IDRA21 potentiate glutamate-evoked currents in a dose-dependent manner.
3FURA is always more potent and efficacious than IDRA21, even though the association of KA1 and KA2 with GluR5 causes a drastic reduction in its potency. IDRA21 instead maintains similar behavior in all the subunit combinations tested, except for GluR6-KA1/KA2, where its efficacy is lower.
In HEK expressing GluRA and GluRB subunits of AMPA receptor, 3FURA potency is one order of magnitude bigger than that of IDRA21 (EC50 RAC~50uM and EC50 IDRA21~500uM).
Then, we study the effects of IDRA21 and 3FURA on the NMDA-evoked currents in fibroblasts stably expressing NR1A-2A or NR1A-2B NMDA-subunits combination.
Given the promising pharmacological profile, 3FURA could represent a new lead for the generation of compounds useful in the treatment of pathology such as schizophrenia or neurodegenerative diseases (AD and PD) characterized by alterations in iGluRs function.
Future experiments in vivo will be fundamental to evidentiate the behavioral effect of 3FURA and derivative and will allow us to gain more insight in the mechanism of action of these PAMs.
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