• bFGF
• HOXB7
• invecchiamento
• MSC
• senescenza

Le cellule stromali mesenchimali (MSC) isolate in origine dal midollo osseo (BM), sono progenitori multipotenti in grado di differenziare in diversi tipi cellulari tra cui osteoblasti, condrociti, miociti e adipociti. Sempre più studi indicano la presenza di MSC anche nel tessuto adiposo, cordone ombelicale, placenta, liquido amniotico, endometrio, sangue mestruale, muscolo, fegato e polpa dentale.
La capacità differenziativa e l’elevato potenziale di espansione ex vivo delle MSC, hanno fatto di loro un attraente strumento sia in terapia cellulare che ingegneria tessutale. Le MSC sono, infatti, attualmente in uso sia in ambito preclinico che clinico pur essendo oggetto di controversie, legate ad un’incompleta conoscenza delle loro caratteristiche. Per tali motivi è opportuno identificare marcatori molecolari che possano migliorare le loro prestazioni a lungo termine sia in vitro che in vivo.
I geni HOX sono componenti fondamentali del patterning embrionale, della morfogenesi e persistono in età adulta. Molti studi supportano il loro coinvolgimento in diversi processi fondamentali delle cellule staminali, come acquisizione dell’identità posizionale, autorinnovamento e differenziamento. Diversi studi suggeriscono anche il coinvolgimento dei geni HOX nelle neoplasie.
Recentemente il nostro gruppo di ricerca ha identificato HOXB7 come fattore chiave che guida le BM-MSC nella proliferazione e nel differenziamento, dimostrando che una forzata espressione di HOXB7 è associata ad un aumento della crescita cellulare, a una ridotta senescenza e ad una aumentata osteogenesi.
L’obbiettivo di questo studio è valutare l’impatto della sovra espressione di HOXB7 sulle MSC adipose (AD) e valutare se l’influenza di tale sovra espressione è uguale a quella ottenuta sulle BM-MSC.
Per studiare tale effetto, tre campioni umani di AD-MSC, sono stati isolati, espansi e trasdotti con un vettore codificante HOXB7 o con un vettore vuoto come controllo.
La sovra espressione di HOXB7 è stata confermata in real time-PCR e le cellule sono state amplificate e valutate per morfologia, fluorescenza e immunofenotipo. Al microscopio tutti i campioni hanno evidenziato cambiamenti morfologici correlati ad HOXB7, mentre l’immunofenotipo non è stato influenzato. In particolare, i campioni MSC-HOXB7 sono stati associati ad una migliore performance proliferativa, rispetto ai controlli, correlata ad un’aumentata espressione di ki67. Il potenziale proliferativo delle MSC-HOXB7 è stato poi studiato in termini di senescenza, valutando l’invecchiamento cellulare in vitro con la colorazione -Galattosidasi, confermando un ridotto numero di cellule positive e suggerendo un’azione di HOXB7 anche sulla senescenza.
HOXB7 regola diversi geni coinvolti nella proliferazione, differenziazione e segnalazione recettoriale, infatti le MSC-HOXB7 mostrano un’aumentata espressione di bFGF che potrebbe giustificare i cambiamenti rilevati, rendendolo un fattore chiave per contrastare l’invecchiamento.
Abbiamo poi valutato se la sovra espressione di HOXB7 potesse agire sul potenziale differenziativo eseguendo saggi in vitro di differenziamento osteogenico utilizzando BMP-2, di differenziamento condrogenico su pellet cellulare utilizzando BMP-6 e di induzione adipogenica. Le MSC-HOXB7 hanno mostrato una più alta mineralizzazione misurata attraverso la colorazione von Kossa e una maggior presenza di cartilagine valutata attraverso il saggio della Safranina O rispetto al controllo, mentre l’induzione adipogenica non ha rivelato particolari differenze delle MSC-HOXB7 rispetto al controllo.
Questa piattaforma sperimentale, da consolidare su modelli in vivo, suggerisce che le MSC-HOXB7 potrebbero rappresentare uno strumento utile per le applicazioni innovative nell’ambito della rigenerazione tessutale.

Mesenchymal stromal/stem cells (MSC) are multipotent progenitors that were originally isolated from bone marrow (BM). They can differentiate into a variety of cell type including osteoblast, chondrocytes, myocytes, and adipocytes. Increasing evidence indicates that MSC are also present in non-BM tissues such as adipose tissue (AD), umbilical cord blood, placenta, amniotic fluid, endometrium, menstrual blood, muscle, liver and dental pulp. The ability of MSC to differentiate into a variety of cell types, as well as their high ex vivo expansion potential, make them an attractive therapeutic tool for cell transplantation and tissue engineering. As matter of fact, MSC are already in use for pre-clinical and clinical applications in the field of regenerative medicine. Although the use of MSC is currently challenged in a growing number of clinical trials, it is desirable to identify molecular markers that may help improve their long term performance both in vitro and after transplantation. HOX genes are fundamental components of embryonic patterning and morphogenesis with expression persisting into adulthood. Several studies support the involvement of HOX genes at several levels along the stem cell hierarchy, including positional identity, stem cell self-renewal and differentiation. There is also strong evidence suggesting HOX genes play a role during neoplasia. Recently, our research group has identified HOXB7 as a master player driving BM-MSC proliferation and differentiation; we showed that a forced HOXB7 expression in BM-MSC is associated with an improved cell growth, a reduction of senescence and an improved osteogenesis. The aim of this project has been to study the impact of HOXB7 overexpression in AD-MSC to investigate whether the influence on AD-MSC is equal to BM-MSC. To study whether an overexpression on HOXB7 could improve cell performance of AD-MSCs, three human AD-MSC samples were isolated, expanded and transduced by a vector encoding HOXB7 or by an empty vector as control. HOXB7 overexpression was confirmed by real-time PCR and cells were amplified and evaluated for morphology, fluorescence and antigenic profile. Microscopic visual assessments showed HOXB7-related morphological changes in all samples, while with regard to surface markers MSC immunophenotype was not influenced by HOXB7. In particular, MSC-HOXB7 samples were associated with a better proliferative performance compared to the relative control, associated with an increase in ki67 levels. The proliferative potential of MSC-HOXB7 was then also studied in terms of senescence, measuring cellular aging in vitro using a -Galactosidase (-Gal) staining, confirming a lower quote of -Gal positive cells and suggesting that HOXB7 action impacts on in vitro senescence. HOXB7 regulates several genes playing a significant role in cell proliferation, differentiation and receptor signaling, such as bFGF. HOXB7-modified MSC showed enhanced bFGF expression that may explain the induced MSC changes, rendering bFGF a key factor to counteract aging. Since MSC can differentiate into a variety of tissues, we evaluated whether HOXB7 overexpression may be associated to an increased osteogenic, chondrogenic and adipogenic potential. Thus, a BMP-2 in vitro assay, a pellet culture BMP-6 in vitro assay and adipogenic induction were introduced. MSC-HOXB7 showed a higher von Kossa staining and an elevated presence of cartilage in Safranin O staining versus the induced control, while no apparent differences could be detected in inducing MSC-HOXB7 toward adipogenic lineages. This experimental platform, further challenged by in vivo models, suggests that MSC-HOXB7 might be a useful tool for innovative tissue regeneration applications.