• 2
• 3-benzodiazepine
• apoptosi
• ciclo-cellulare
• citotossicità
• proliferazione

Lo sviluppo di terapie mirate per il trattamento di tumori maligni è aumentato notevolmente negli ultimi anni. Questo progresso ha consentito di ridurre al minimo gli effetti collaterali e, in alcuni casi, il numero di morti. Tuttavia, nonostante questi progressi, il cancro è ancora la prima causa di morte nei paesi occidentali. In questa prospettiva, molte molecole sono state sintetizzate al fine di sfruttare le loro caratteristiche per regolare specifiche pathways coinvolte nella proliferazione cellulare. IL GYKI 52466 è una 2,3-benzodiazepina che agisce selettivamente su un recettore AMPA come antagonista allosterico non-competitivo. È noto per avere proprietà anticonvulsivanti e neuroprotective. Alcuni studi hanno riferito gli effetti anti-proliferativi del GYKI 52466 su diverse linee cellulari tumorali, inibendo la extracellular signal regulated kinase (ERK1/2). L'obiettivo del presente progetto di tesi è quello di indagare l'effetto citotossico di un nuovo derivato 2,3-benzodiazepinico, un AMPA antagonistà non competitivo, chiamato composto 1g, su diverse linee cellulari tumorali al fine di identificare una possibile nuova molecola per la terapia del cancro. In particolare in questo progetto di tesi di dottorato, abbiamo testato il composto 1g su un pannello di 16 linee cellulari, considerando la varietà fenotipica di ogni linea cellulare (PLC/PRF/5, U-87MG, HEP-G2, HT-29, KG-1, Kasumi, HL60, NB4, Jurkat T cells, U937, HCT116, SH-SY5Y, granulles cells, DRG, NIH-3T3, linfociti T periferici). Inoltre abbiamo esplorato il meccanismo di morte cellulare e la capacità di questo composto ad arrestare il ciclo cellulare in cellule leucemiche jurkat T cells.
RISULTATI: Il composto 1g ha mostrato una importante attività citotossica e antiproliferativa nelle 16 linee cellulari tumorali umane testate con un valore di GI50 variabile da 1,5 a 50 µM, mentre sulle cellule wild type (granulles cells, DRG, NIH-3T3, linfociti T periferici), il composto ha esibito una bassa citotossicità. È stata esplorata la distribuzione del ciclo cellulare nelle jurkat mediante analisi di incorporazione della BrdU. L'aumento della percentuale delle cellule jurkat in fase G2/M (24,7%) e conseguente calo della fase G0/G1 è stato osservato dopo incubazione di 24 ore con 1g alla concentrazione di 1.5 M. Dopo 48 ore le percentuali delle cellule andate incontro a meccanismo di morte cellulare per apoptosi e/o necrosi sono state rilevate tramite citofluorimetria dopo colorazione con Annessina V-FITC e PI. Si è evidenziata la capacità del composto 1g a provocare un aumento significativo di apoptosi precoce dopo 24 ore di incubazione mentre dopo 48 ore il composto causa una forte induzione di apoptosi tardiva e necrosi in cellule trattate. è stata valutata mediante western blot l’espressione di specifiche proteine coinvolte nel meccanismo di morte cellulare mediato da 1g. In particolare, si è osservato un aumento della P53 mentre la proteina antiapoptotica bcl-xl e bcl-2 risultano diminuite in modo dose-dipendente nelle cellule Jurkat. È stato inoltre valutato il meccanismo d’azione coinvolto nell’arresto del ciclo cellulare, precisamente durante la transizione G2/M. Abbiamo trovato un aumento significativo della ciclina B1, Myt-1, P-H3 e P-Cdc2, mentre diminuisce l’espressione della Wee1 e P-Wee1.
In conclusione, i nostri dati dimostrano chiaramente che il composto 1g è in grado di arrestare in fase G2/M il ciclo cellulare nelle cellule leucemiche jurkat T cells dopo 12 ore di incubazione e di conseguenza di indurre apoptosi precoce e tardiva. Presi insieme, questi risultati suggeriscono che questa molecola potrebbe agire principalmente come un composto citostatico piuttosto che citotossico.

The development of targeted therapies to treat malignancies has increased significantly in recent years. This progress has allowed to minimize side effects and, in some cases, the number of deaths. However, despite these progress, cancer is still the first cause of death in western countries. In this perspective, many molecules have been synthesized in order to exert their function through specific pathways involved in cell proliferation. GYKI 52466 is a 2,3-benzodiazepine which acts as a selective non-competitive allosteric AMPA receptor antagonist. It is known to have anticonvulsant and neuroprotective properties. Some studies have reported the anti-proliferative effects of GYKI 52466 on different cancer cell lines, by inhibiting the extracellular signal regulated kinase (ERK1/2) pathway, which is involved in cell proliferation. The aim of the present project is to investigate the cytotoxic effect of a novel 2,3-benzodiazepine derivatives, a non-competitive AMPA antagonists, called 1g compound, against different cancer cell lines in order to identify a possible new molecule for cancer therapy. In particular in this PhD project, we tested the 1g compound in a panel of 16 cell lines, considering the phenotypic variety of each cell line (PLC/PRF/5, U-87MG, HEP-G2, HT-29, KG-1, Kasumi, HL60, NB4, Jurkat, U937, HCT116, SH-SY5Y, Granule cells, DRG, NIH-3T3, Peripheral T lymphocytes). Moreover we also explored the mechanism of cell death and tested the ability of this compound to arrest cell cycle in leukemia jurkat T cells. RESULTS: 1g compound showed important cytotoxic and antiproliferative activity in the 16 human cancer cell lines tested with a GI50 value ranged from 1,5 to 50 µM, whereas on wild type cell lines (Granule cells, DRG, NIH-3T3, Peripheral T lymphocytes), the compound exhibited low cytotoxicity. To explore the mechanism for 1g-induced cell growth inhibition, the effect of 1g on cell cycle distribution was determined in leukemia jurkat T cells using BrdU incorporation analysis. The increase of percentage of jurkat T cells in G2/M phase (24.7%) was observed after 24 h of incubation with 1g at 1.5 M concentration in a time dependent manner. In parallel, there was a corresponding decrease in the percentage of cells in the G0/G1 phase compare to the control. After 48 h of incubation, 1g produced a massive increase of cell death. Moreover we characterize the relationship between cell cycle arrest and cell death mediated 1g compound in jurkat T cells at 24-48 h time points. The percentages of cells undergoing apoptosis and/or necrosis were detected by flow cytometry after staining with annexin V-FITC and PI. Compound 1g elicited a significant increase of early apoptosis after 24 h of incubation, and after 48 hours the compound produced a marked induction of late apoptosis and necrosis in the treated cells. The specific molecular pathway involved in the activity of 1g was identify by western blot method. In particular we observe an increase of P53 a proapoptotic mediator whereas the antiapoptotic protein bcl-xl and bcl-2 was down regolated in dose dependent maner in Jurkat T cells. In other hand we investigated the mechanism by which 1g induce cell cycle arrest at G2/M transition. We found a significant increase of cyclin B1, Myt-1, P-H3 and P-Cdc2, whereas Wee1 and P-Wee1 was down regulated. In conclusion, our data clearly shown that 1g compound was able to arrest in G2/M phase the cell cycle of leukemia jurkat T cells after 12 h of incubation and therefore to induce early and late apoptosis. Taken together these findings suggest that this molecule might act mostly as a cytostatic rather then cytotoxic compound.