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• escape
• lysosomal
• Nanoparticles
• targeting

Le nanoparticelle polimeriche (NPs) hanno suscitato molto interesse grazie alla loro versatilità formulativa e alle capacità di stabilizzare e direzionare farmaci al sito d’azione. Tuttavia, l’efficienza nel modulare il rilascio e nel direzionare selettivamente farmaci risulta spesso limitata dal necessario superamento di numerose e diverse barriere fisiologiche. Nella mia ricerca ho approcciato tecnologicamente tali problematiche introducendo modifiche atte e guidare il destino delle NPs verso bersagli cellulari e intracellulari.
Lo studio è stato realizzato in più fasi:
1. Superamento di barriere biologiche altamente strutturate: la Barriera Emato-Encefalica (BEE) La BEE rappresenta uno dei principali ostacoli per la terapia di patologie cerebrali. Il nostro gruppo ha dimostrato come NPs di PLGA coniugate con il glicopeptide g7 (g7-NPs) siano in grado di attraversare la BEE in modelli murini (1,2). Partendo da g7-NPs, sono state analizzate strategie alternative per il direzionamento cerebrale, con meccanismi di attraversamento della BEE già impiegati in natura da sostanze di origine microbica come il mutante non tossico della tossina difterica (CRM197). CRM197-NPs hanno dimostrato capacità di caricare, stabilizzare e modulare il rilascio di farmaci modello. Studi su topi hanno confermato la capacità di tali NPs di attraversare la BEE utilizzando più meccanismi (3,4), raggiungendo aree cerebrali diverse.
Nonostante il PLGA rappresenti una delle migliori opzioni in termini di versatilità e biocompatibilità, la ricerca è stata in parte rivolta allo studio di biomateriali alternativi, totalmente "self" che consentano di eliminare l'impiego di solventi organici e tensioattivi non ammessi. Approfittando del meccanismo reversibile di disassemblaggio e riasemblaggio pH-dipendente dell’Apoferritina, è stato avviato uno studio preliminare sull’impego della proteina come possibile drug carrier (5).
2. Perfezionamento del targeting: direzionamento cellulare Considerando che le g7-NPs raggiungono le diverse aree cerebrali con un loro trofismo, la fase avanzata del progetto ha previsto il potenziamento della selettività verso popolazioni neuronali specifiche, coinvolte in processi neurodegenerativi come la malattia di Parkinson (PD). A tale scopo un peptide derivato dall’α-conotossina con elevata affinità per i recettori nicotinici α62 (espressi dai neuroni dopaminergici mesostriatali coinvolti nel PD) è stato coniugato alla superficie delle g7-NPs. Tali vettori doppiamente ingegnerizzati, testati su modelli murini, sarebbero in grado di attraversare la BEE e targettizzare questa specifica popolazione neuronale (6).
3. Elusione di compartimenti intracellulari: i lisosomi Il meccanismo di uptake e trafficking cellulare più accreditato per NPs consiste nell’endocitosi con inevitabile passaggio in vescicole endo-lisosomiali. L’azione terapeutica del farmaco veicolato può dipendere dai tempi di permanenza del vettore nei compartimenti suddetti, dalla stabilità e dalla possibilità di evadere e rilasciare l’attivo nel citoplasma. Per evitare la degradazione lisosomiale e favorire il rilascio del farmaco a livello citoplasmatico, è stata proposta la formulazione di NPs ibride ottenute utilizzando PLGA e il lipide pH sensibile DOPE (7). Esperimenti in vitro su diverse linee cellulari hanno evidenziato come tali NPs ibride (anche caricate con proteine modello), a seguito della loro internalizzazione, siano in grado di destabilizzare temporaneamente l’integrità lisosomiale e di accumularsi a livello citoplasmatico.

1. Tosi et al. Nanomed. 2011.
2. Vilella et al. J Controlled Release. 2014.
3. Gaillard et al. Int Congr Ser. 2005.
4. Wang et al. J Mol Neurosci. 2011.
5. Molino et al. Curr Opin Biotechnol. 2014.
6. Pucci et al. FASEB J Off Publ Fed Am Soc Exp Biol. 2011.
7. Chhabra et al. Int J Pharm. 2014.

Polymeric nanoparticles (NPs) received great interest due to the versatility of formulations and their ability in protecting and delivering drugs to the site of action. The journey of NPs to the target site and therefore the activity of the loaded drug are limited by a number of physiological barriers. Our researches aimed to investigate the possibility to drive NPs towards cellular and intracellular targets, changing their destiny and ameliorating the selectivity and therapy. In function of different objectives, we organized the research in multiple steps: 1.Crossing Biological Barriers: the case of Blood Brain Barrier (BBB) BBB represents a main hurdle for drug delivery to the Central Nervous System (CNS). Our research group demonstrated that PLGA NPs conjugated with glycopeptide (g7-NPs) were able to efficiently cross BBB in rodents, becoming a promising option for the treatment of brain diseases (1,2). Starting from this consolidated approach we investigated alternative strategies for their delivery to the brain, taking advantages of BBB crossing pathways naturally used by substances of microbial origin as the non-toxic mutant of diphtheria toxin (CRM197). After administration in rodents, CMR197-modified PLGA NPs were able cross the BBB by multiple BBB crossing mechanisms (3,4) and to mediate cellular interaction in the brain parenchyma. Technological and pharmacological studies confirmed also that it is possible to load, stabilize and modulate the release of model drugs from CRM197-NPs, obtaining a potential drug carrier for the treatment of brain diseases. Moreover, notwithstanding PLGA remains one of the best compromises between versatility and biocompatibility in production of NPs, a part of our researches was devoted to test alternative biomaterials, totally “self”. This biopolymer could substitute PLGA in the preparation of targeted NPs avoiding the use of both organic solvents and not admitted surfactants. In this view, in a preliminary study 12-nm Apoferritin protein cage was investigated as possible drug carrier, taking advantage of its reversible pH-dependent dissociation and reassembly (5). 2.Refining the destiny: cellular targeting Beside the ability of NPs to efficiently reach brain areas, in order to enhance the efficacy of delivered drugs, a more ambitious project focused on designing NPs specifically targeted to CNS cell populations, in particular those involved in neurodegeneration (as in Parkinson’s Disease, PD). In this regard an α-conotoxin related peptide with high affinity to α62 nicotinic acetylcholine receptors (expressed by mesostriatal dopaminergic neurons, involved in PD) was conjugated to the surface of g7-NPs. These double engineered NPs, tested in rodents, would be able to cross the BBB (g7-technology) and then to target mesostriatal dopaminergic neurons (6). 3.Escaping intracellular compartments: the case of lysosomes After NPs internalization in target cells, a precise sub-cellular release of the drug is due to exert therapeutic function. Cellular uptake of polymeric NPs mainly occurs via endocytic internalization leading to NPs content's release within lysosomes. To overcome lysosomal degradation and to achieve NPs and/or loaded drugs release into cytosol, we proposed the formulation of hybrid NPs by adding DOPE as pH sensitive lipid in the formulation of PLGA NPs (7). In vitro experiments on different cell lines clearly evidenced that after their internalization, these hybrid NPs (also loaded with model proteins) were able to escape from lysosomal compartment by transiently destabilization of lysosome integrity and to get cytoplasmic accumulation of both NPs and protein cargo. 1.Tosi et al. Nanomed. 2011. 2.Vilella et al. J Controlled Release. 2014. 3.Gaillard et al. Int Congr Ser. 2005. 4.Wang et al. J Mol Neurosci. 2011. 5.Molino et al. Curr Opin Biotechnol. 2014. 6.Pucci et al. FASEB J Off Publ Fed Am Soc Exp Biol. 2011. 7.Chhabra et al. Int J Pharm. 2014.