Riassunto analitico
Erwinia amylovora è l'agente patogeno responsabile del colpo di fuoco batterico - la malattia batterica più temuta in melo (Malus × domestica) e dagli altri membri della famiglia delle Rosaceae. La malattia è molto distruttiva è difficile da controllare. Anche se il colpo di fuoco è stato osservato per la prima volta oltre due secoli fa in America, nessuna misura di controllo sostenibile è nota fino ad ora. Le pratiche di gestione delle malattie come la potatura dei tessuti colpiti, nonché l'applicazione di rame e antibiotici (per esempio, streptomicina) servono a minimizzare la popolazione di E. amylovora in un frutteto. Tuttavia, l'uso della streptomicina non è consentito in molti paesi europei come conseguenza dei suoi rischi ambientali e per il problema dell’incremento di resistenza nelle popolazioni di E. amylovora agli antibiotici. Pertanto, la resistenza naturale è pensata come l'approccio più sostenibile per gestire il colpo di fuoco. La resistenza genetica è stata studiata in Malus ha portato alla individuazione di diversi loci di caratteri quantitativi (QTL) in cultivar di melo e specie selvatiche. Tuttavia, solo un gene di resistenza è stato caratterizzato dal punto di vista funzionale ed isolato fino ad oggi. Questa situazione, insieme con il fatto che la resistenza è ceppo specifica, rafforza la necessità di individuare più donatori che potrebbero essere utilizzati per stabilire la resistenza durevole contro il fuoco batterico. Per questo motivo, i lavori descritti in questa tesi sono rivolti allo studio della resistenza al colpo di fuoco batterico in altre specie selvatiche di melo - Malus fusca. Diverse accessioni di M. fusca sono state fenotipizzate in JKI, Dresda, Germania per accertare l'accessione con un alto livello di resistenza. L’accessione MAL0045, la quale mostra un livello molto elevato di resistenza, è stata incrociata con la cultivar di melo molto sensibile 'Idared' ed è stata creata una popolazione F1 segregante di 134 individui. Per facilitare lo sviluppo di una mappa genetica di M. fusca, marcatori molecolari, come DArT (Diversity Array Technology), SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) e SSR (Simple Sequence Repeats) sono stati sviluppati, testati e quelli polimorfici applicati al 134 individui e quindi mappati. I dati fenotipici e genotipici sono stati impiegati per le analisi QTL essi hanno portato alla individuazione di un importante locus quantitativo che si trova sul gruppo linkage 10 (LG10) del genoma del melo e potrebbe spiegare circa il 66% della variazione fenotipica; il secondo effetto più alto di tutti i QTL in precedenza rilevati in Malus. Inoltre, questa tesi descrive anche la stabilità e la convalida del locus (Mfu10) in M. fusca per la resistenza al fuoco batterico dopo un'altra valutazione fenotipica della popolazione F1 con un ceppo altamente virulento di E. amylovora Ea3049 proveniente dal Canada. Inoltre, la mappatura fine della regione di resistenza è stata effettuata tramite approccio ”chromosome walking” con lo sviluppo di marcatori SSR strettamente connessi adatti alla selezione assistita da marcatori (MAS). A tal fine, la popolazione è sostanzialmente aumentata a 1.336 individui da un’incrocio supplementare di M. fusca × 'Idared' e un’incrocio reciproco di 'Idared' × M. fusca. La genotipizzazione di tutta la popolazione ha permesso l'identificazione di individui che mostrano eventi di ricombinazione entro l'intervallo della regione QTL. La fenotipizzazione di individui ricombinanti ha permesso di confermare che la posizione esatta del QTL era ben definita. I primi passi verso la scoperta del gene (geni) responsabile per la resistenza del colpo di fuoco batterico in M. fusca sono stati raggiunti con lo sviluppo e lo screening di una collezione di cromosomi batterici artificiali (BAC) di M. fusca con marcatori SSR strettamente connessi a Mfu10, portando all'individuazione di alcuni cloni BAC nell'intervallo QTL.
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Abstract
Erwinia amylovora is the pathogen responsible for inciting fire blight - the most dreaded bacterial disease of apple (Malus × domestica) and other members of the Rosaceae family. The disease is very destructive as is difficult to control. Even though fire blight was first observed over two centuries ago in America, no sustainable control measure is known till date. Disease management practices such as pruning of affected tissues as well as the application of copper and antibiotics, for example, streptomycin, are to minimize the population of E. amylovora in an orchard. However, the use of streptomycin is not allowed in many European countries as a consequence of its environmental risks and the issue of raising antibiotic resistant E. amylovora populations. Therefore, natural resistance is thought to be the most sustainable approach to manage fire blight. Genetic resistance has been investigated in Malus leading to the detection of several quantitative trait loci (QTLs) in apple cultivars and apple wild species accessions. Nevertheless, only one functionally characterized fire blight resistance gene has been isolated till date. This situation, coupled with the proof that resistance is strain specific, reinforces the need to detect more donors that could be used to establish durable resistance against fire blight. For this reason, the works described in this thesis aimed at investigating fire blight resistance in another apple wild species – Malus fusca. Different accessions of M. fusca were phenotyped in JKI, Dresden, Germany to ascertain the accession with a high resistance level. Accession MAL0045, found as having a very high resistance level was then crossed with the very susceptible apple cultivar ‘Idared’ to establish a segregating F1 population of 134 individuals. To facilitate the development of a genetic map of M. fusca, molecular markers such as DArT (Diversity Arrays Technology), SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) and SSRs (Simple Sequence Repeats) were developed, sourced, tested and polymorphic ones applied to the 134 individuals and then mapped. The phenotypic and genotypic data were employed for QTL analyses which resulted in the identification of a major quantitative trait locus which is located on linkage group 10 (LG10) of the apple genome and could explain about 66 % of the phenotypic variation; the second highest effect of all QTLs previously detected in Malus. Furthermore, this thesis also describes the stability and validation of the M. fusca fire blight resistance locus (Mfu10) after another phenotypic evaluation of the F1 population with a highly virulent E. amylovora isolate Ea3049 originating from Canada. Moreover, the fine mapping of the resistance region was undertaken via chromosome walking approach with the development of closely linked SSR markers suitable for marker assisted selection (MAS). For this purpose, the population was substantially increased to 1,336 individuals from an additional cross of M. fusca × ‘Idared’ and a reciprocal cross of ‘Idared’ × M. fusca. Genotyping of the whole population allowed for the identification of individuals showing recombination events within the interval of the QTL region. Phenotyping of recombinant individuals ensured that the exact position of the QTL was well defined. The first steps towards uncovering the underlying gene(s) responsible for the resistance of fire blight in M. fusca have been achieved with the development and screening of a M. fusca bacterial artificial chromosome (BAC) library with SSR markers closely linked to Mfu10 and the identification of some BAC clones in the QTL interval. This is the first report of a major quantitative trait locus for resistance to fire blight in this wild relative of apple. The implications of the results obtained in these research works in respect to breeding for resistance against the very destructive fire blight disease of Malus are discussed extensively.
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