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Negli ultimi anni, l’interesse nei confronti dei prodotti naturali ha avuto una crescita esponenziale, non solo nel campo fitoterapico, ma anche in quello nutraceutico. Al fine di garantire l’efficacia terapeutica e la sicurezza di questi prodotti, risulta fondamentale sviluppare metodologie analitiche avanzate, che consentano la determinazione quali- e quantitativa di tutti i metaboliti secondari presenti negli estratti vegetali. Per raggiungere tali obiettivi, il metabolite profiling, basato sullo studio di molecole chimicamente correlate tra loro o coinvolti in specifiche vie metaboliche, e il metabolite fingerprinting, basato sullo studio di tutti i metaboliti secondari presenti nel campione, sono da considerarsi approcci preferenziali.
Alla luce di questo, l’obiettivo del mio progetto di Dottorato di Ricerca è stato lo sviluppo di metodi analitici altamente efficienti e innovativi per lo studio quali- e quantitativo di metaboliti secondari presenti in estratti vegetali di potenziale interesse fitoterapico e nutraceutico. In tale ambito mi sono occupato della completa caratterizzazione dei metaboliti secondari contenuti nella propoli, Vaccinium floribundum Kunth, Humulus lupulus L. e Punica granatum L..
Inizialmente è stato svolto il metabolite profiling dei polifenoli presenti in campioni di propoli di diversa provenienza estratti mediante tecnica assistita da microonde. Per la loro analisi è stato sviluppato un nuovo metodo RP-HPLC con colonna fused-core di nuova generazione e rivelatore UV/DAD ed ESI-MSn. Al fine di completare la caratterizzazione fitochimica di propoli, sono state condotte analisi GC-MS della frazione volatile, dopo aver ottimizzato un’appropriata procedura HS-SPME.
Proseguendo lo studio sui polifenoli, è stato descritto il metabolite profiling di V. floribundum Kunth in relazione al più noto V. myrtillus L.. Per massimizzare l’efficienza di estrazione a fini analitici dei metaboliti secondari è stata sviluppata una nuova procedura selettiva che consente, una volta separati i flavonoidi e gli acidi fenolici, un’estrazione specifica per le antocianine. Gli estratti così ottenuti sono stati analizzati mediante metodologie HPLC-UV/DAD, ESI-MS e MS2 opportunamente ottimizzate.
Al fine di descrivere approfonditamente il contenuto di prenilflavonoidi e prenilfloroglucinoli in H. lupulus L. (luppolo), è stata messa a punto, ottimizzata ed applicata una tecnica analitica HPLC-UV/DAD, ESI-MS e MS2, basata sull’utilizzo di colonne cromatografiche fused-core.
Infine, nell’ambito dei prodotti nutraceutici, è stato oggetto di ricerca il succo e le altre strutture tissutali del frutto di P. granatum L. (melograno). Sono stati ottenuti ottimi risultati mediante l’utilizzo di una fase stazionaria fused-core, che ha permesso la prima analisi HPLC simultanea di tutti i composti del melograno in un’unica corsa cromatografica.
Inoltre, nell’ambito di questo progetto di Dottorato, è stato dato un contributo significativo anche ad altri progetti di ricerca, in collaborazione con altre Università italiane e straniere, sviluppando metodi analitici per la caratterizzazione dei metaboliti secondari presenti in varie specie di interesse fitochimico e fitoterapico, quali Terminalia chebula Retz., Tamarix aphylla L., Echinacea pallida (Nutt.) Nutt. e Paronychia argentea L.
In conclusione, i metodi analitici sviluppati nel corso di questo Dottorato rappresentano strumenti altamente efficienti e affidabili per la caratterizzazione dei metaboliti secondari in matrici complesse di origine vegetale. Le tecniche estrattive e i metodi analitici sviluppati sono stati validati secondo le linee guida ICH e successivamente applicati a diversi campioni, dimostrando la loro efficacia d’impiego nel metabolite profiling e fingerprinting di prodotti naturali di notevole interesse fitoterapico e nutraceutico.

In recent years, the interest in natural products has grown exponentially, not only in the field of herbal medicine, but also in the nutraceutical one. In order to ensure the therapeutic efficacy and the safety of these products, it is important to develop advanced analytical methods for the quali- and quantitative analysis of secondary metabolites in plant extracts. To achieve these goals, metabolite profiling, based on the study of chemically related compounds or secondary metabolites involved in specific biosynthetic pathways, and metabolite fingerprinting, based on the full characterization of samples by complete analysis of its secondary metabolites, are highly recommended methodologies in the ambit of natural product analysis. In the light of this, my PhD project was focused on the development of highly efficient and innovative analytical methods for the comprehensive multi-component analysis of bioactive secondary metabolites from different natural sources. In this context, the complete characterization of secondary metabolites in propolis, Vaccinium floribundum Kunth, Humulus lupulus L. e Punica granatum L. was carried out. Initially, the metabolite profiling of polyphenols in propolis samples from different origin was performed, after an optimized microwave-assisted extraction. For the HPLC analysis an efficient reversed-phase method was developed using the new fused-core column technology and UV/DAD and ESI-MSn detection. To complete the phytochemical characterization of propolis, GC-MS analyses were carried out on the volatile part, after the optimization of a suitable HS-SPME extraction procedure. In the same way, the metabolite profiling of polyphenols in V. floribundum Kunth in comparison with V. myrtillus L. was described. A sequential selective extraction procedure was developed to maximize the yields of the secondary metabolites from the berries, where first flavonoids and phenolic acids were extracted, followed by a specific extraction for anthocyanins. Both berry extracts were analyzed by means of HPLC-UV/DAD, ESI-MS and MS2. In order to describe in detail prenylflavonoids and prenylphloroglucinols in H. lupulus L. (hop), a HPLC-UV/DAD, ESI-MS and MS2 method was developed, using the fused-core column technology. Finally, in the ambit of nutraceuticals, the juice and other fruit tissues of P. granatum L. (pomegranate) were studied. Excellent results were obtained through the use of the fused-core stationary phase, since it allowed the first simultaneous analysis of all pomegranate constituents in a single chromatographic run. Furthermore, as part of this PhD project, a significant contribution was given to other research projects, in collaboration with other Italian and foreign universities, developing analytical methods for the characterization of secondary metabolites present in various species of particular phytochemical and phytotherapic interest, such as Terminalia chebula Retz., Tamarix aphylla L., Echinacea pallida (Nutt.) Nutt. and Paronychia argentea L.. In conclusion, the analytical methods developed during my PhD can be considered highly efficient and reliable tools for the characterization of secondary metabolites in complex matrices of natural origin. The extraction procedures and the analytical methods were fully validated in agreement with ICH guidelines, and then applied to different samples. The results obtained in these studies demonstrated the reliability of the proposed methods for the metabolite profiling and fingerprinting of natural products with a considerable phytotherapic and nutraceutical interest.