Riassunto analitico
introduzione il cancro ovarico e’ la quinta causa più comune di morte per cancro nelle donne. il trattamento di prima linea è costituito da derivati del platino più paclitaxel che spesso dà luogo a insorgenza resistenza con meccanismi ancora poco chiari. tuttavia, e' evidente che il processo di resistenza comprende la sovraespressione di timidilato sintasi, un enzima coinvolto nel metabolismo dei folati. farmaci diretti al metabolismo dei folati sono attualmente in studio clinico per il trattamento di rco. uno dei più studiati è pemetrexed (pmx), farmaco multi target, in fase clinica ii per il trattamento di tumori ginecologici. il mio gruppo di ricerca è attivo nella scoperta di nuovi agenti terapeutici contro roc e recentemente ha sviluppato una nuova classe di inibitori peptidici di ts che sopprimono l'attività dell’enzima senza provocare la sua sovra espressione. in particolare, l’octapeptide lr ed il suo analogo dgln4lr hanno mostrato un’alta citotossicità su linee cellulari di co. il fallimento dei candidati farmaci durante le prime fasi della sperimentazione clinica rimane il problema principale nel processo di drug discovery. è per questo che la sfida attuale è di individuare un pannello proteico la cui espressione possa essere informativa degli effetti dei candidati farmaci durante le fasi precliniche e cliniche dello sviluppo del farmaco. obiettivo l'obiettivo di questo lavoro è studiare variazioni proteomiche derivanti dall’azione di agenti diretti contro il metabolismo dei folati. in particolare, il fine ultimo è di identificare un pannello di proteine caratterizzanti l’attività di candidati farmaci nel trattamento del cancro ovarico e di ottenere maggiori informazioni sul loro meccanismo di azione, mediante l’utilizzo di diversi approcci basati sulla spettrometria di massa. identificazione di una protein signature per definire un pannello di proteine predittivo ed informativo degli effetti biologici del peptide lr su linee cellulari di co, è stato utilizzato un approccio proteomico basato su ms e supportato da uno studio di bioinformatica. sono state così selezionate nove proteine ts, dhfr, trap1, hsp90aa1, gart, atic, shmt1, mthfr, mgmt, la cui espressione è stata validata su tre linee di cellule co mediante western blot, dopo trattamento con il peptide lr, il suo analogo dgln4lr e pmx. i risultati hanno confermato che sei delle nove proteine selezionate forniscono un profilo di espressione specifico dopo il trattamento con i peptidi. questo profilo di espressione è significativamente diverso da quella del pmx, suggerendo un diverso meccanismo di azione dei peptidi rispetto al farmaco di riferimento. studi traslazionali il pannello di proteine identificato è stato successivamente testato in biopsie di pazienti arruolati in uno studio clinico di fase ii per la valutazione di pmx nel trattamento di rco. successivamente, il pannello di proteine è stato ampliato al fine di raggiungere un profilo proteico più informativo della risposta clinica al trattamento pmx. per permettere la quantificazione contemporanea di tutte le proteine del pannello, è stata adottata una tecnica di targetedproteomic basata su ms. il fine è di applicare la strategia precedentemente convalidata su linee cellulari in tessuti di pazienti affette da rco e trattate con pmx. studi di fosfoproteomica il meccanismo di azione di pmx non è del tutto chiaro, ma studi pubblicati hanno evidenziato che pmx esercita il suo effetto citotossico agendo su vie di segnalazione chinasigovernate. per individuare proteine chiave che potrebbero essere perturbate da pmx, è stato adottato un approccio di fosfoproteomica differenziale su linee cellulari di co trattate con pmx. conclusione la metodologia presentata fornisce un approccio interessante per la costruzione di un profilo farmacodinamico atto a monitorare ogni fase del processo di sviluppo del farmaco, dalle fasi precliniche a quelle cliniche.
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Abstract
introduction
ovarian cancer represents the fifth most common cause of death from cancer in women. the standard firstline treatment of oc consists of platinum derivatives plus paclitaxel, that, despite a high initial response, often gives rise to drug resistance onset roc with still unclear mechanisms. however, there is evidence that the resistance process includes the overexpression of thymidylate synthase, a key enzyme involved in folate metabolism, as well as of other enzymes of the folatome. drugs directed to the folate metabolism are less used and under investigation for second line therapy, in combination. among them one of the most studied is pemetrexed. pmx is a wellknown multitarget drug, it is in clinical phase ii for the treatment of oc, and gynecologic neoplasm. my research group is active in the discovery of new therapeutic agents against roc and recently it has developed a new class of peptide inhibitors of ts that suppress its activity without causing its feedback overexpression. in particular, the octapeptide lr and its analog dgln4lr showed the highest cytotoxicity on oc cell lines. the failure of candidate anticancer drugs during the first phases of the clinical trial still remain the main issue in drug discovery process. that is why the current challenge, especially in proteomic field, is to identify novel predictive and/or prognostic pool of proteins, defined as protein signature, which could be informative of the effect of candidate drugs in both the preclinical and clinical phase discovery processes.
objectives
the aim of this work is to study the effect of candidates drugs directed to the folate pathways in the treatment of oc. more in detail, the goal is to determine at a proteome level, molecular events triggered directly or indirectly by folatemetabolism inhibiting agents, in order to better understand the mechanism of action of drugs and, to identify a protein signature that could characterize their activity.
identification of a proteomic signature on oc cell lines. a mass spectrometry based proteomic approach supported by a bioinformatic study was adopted to define a protein expression signature to be used as a predictive and informative indicator of the biological effects of the lr peptide on oc cell lines. the protein signature, composed by nine proteins ts, dhfr, trap1, hsp90aa1, gart, atic, shmt1, mthfr, mgmt was validated on three oc cell lines treated with lr peptide, its analogue dgln4lr, and pmx. results confirmed that six out of the nine selected proteins give a specific protein expression profile after treatment with the peptides. this pattern is significantly different to that of pmx, suggesting a different the mechanism of action of the peptides with respect to this antifolate.
translational studies. the in vitro identified protein panel was tested in biopsies from patients enrolled in a phase 2 clinical trial of pmx in the treatment of roc. subsequently, the protein panel was implemented in order to reach a more informative protein profile of the clinical response to pmx treatment. a targeted proteomic approach was adopted to quantify the enlarged set of proteins with the aim to apply the strategy previously validated on cell lines to oc tissues from patient treated with pmx.
phosphoproteomic studies
the mechanism of action of pmx is not completely clear, but studies highlighted that pmx exerts its cytotoxicity effect acting on kinasegoverned signaling pathways. to search for key proteins that could be perturbed by the treatment, a msproteomic approach was adopted to identify changes in phosphoproteome on ovcar8 cell line after treatment with pmx.
conclusion
this methodology provides an interesting approach to discover molecular drug offtargets that could be part of a pharmacodynamic profile to monitor each phase of the drug development process, from the early steps to the clinical phases.
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