• Drug-resistance
• Folate-receptor
• Ovarian-cancer
• Target-strategy
• Thymidilate-Synthase

Il tumore Ovarico (OC) è la quinta causa di morte più comune per tumore nelle donne e la più letale neoplasia ginecologica [1-3]. La resistenza alla chemioterapia standard [4-6] si instaura rapidamente e la sovra espressione della timidilato sintasi (hTS) è uno dei maggiori meccanismi coinvolti [7]. hTS è una enzima della via metabolica dei folati che catalizza un precursore fondamentale per la sintesi di DNA, nonché bersaglio di importanti farmaci anti tumorali (raltitrexed, pemetrexed e il pro-farmaco 5-fluorouracile) [8]. Recentemente, studi su peptidi specificamente progettati per interagire a livello dell’interfaccia monomero-monomero della TS hanno dimostrato che un peptide (LR e i suoi analoghi) è in grado di inibirne l’attività con un nuovo meccanismo, stabilizzando la forma dimerica inattiva della TS e inibendo così la crescita tumorale, pur mantenendo inalterati i livelli di TS in linee cellulari di tumore ovarico[9]. Durante il mio lavoro di dottorato ho contribuito a dimostrare che il peptide derivato [DGln4] LR mostra un aumentata attività biologica rispetto al peptide LR, pur mantenendo un simile comportamento in linee cellulari di tumore ovarico. (M.Pelà et al., J Med Chem in revisione). Lo specifico meccanismo di azione di questi peptidi non è ancora stato chiarito ed è attualmente in corso di studio. In questo contesto, ho contribuito a confermare la modulazione, indotta dal trattamento, di un profilo proteico, che è stato recentemente identificato attraverso un approccio proteomico e bioinformatico combinato (F.Genovese at al., in preparazione). In particolare mi sono occupata della valutazione della distribuzione del peptide all’interno della cellula, attraverso la microscopia a fluorescenza, osservando che esso sembra localizzarsi in modo preferenziale nel citoplasma. Inoltre un nuovo pteroyl-nonapeptide (FA-LR) coniugato è stato progettato per migliorare l’ingresso del peptide all’interno delle cellule attraverso l’endocitosi mediata dal recettore dei folati (FRα). FRα è un recettore di membrana, sovra espresso in più del 90% dei tumori ovarici non mucinosi. Inoltre, è stato dimostrato che esso è in grado di legare l’acido folico (FA) con elevata affinità e di internalizzare in modo efficiente sia gli analoghi del FA che le molecole ad esso coniugate [10]. Quindi per identificare il modello cellulare più adatto per valutare gli effetti del nostro FA-peptide coniugato, mi sono occupata della analisi dei livelli di espressione di FRα in un pannello di linee cellulari di OC, attraverso l’utilizzo metodi quantitativi e semi quantitativi [10-13]. Studi preliminari hanno mostrato che il coniugato compete con [³H] acido folico per l’entrata attraverso FRαin cellule che sovra esprimono il recettore, (G.Marverti et al., manuscript in preparation). La valutazione degli effetti sulla crescita cellulare e lo studio dell’efficienza della strategia basata sul recettore del folato, attraverso la microscopia a fluorescenza, sono in corso. Questo lavoro è parte del IG grant AIRC 2010 “TARGETING OVARIAN CANCER DRUG RESISTANCE”.
[1] E.Weiderpass, et al., Saf Health Work, 2012, 3, 166-80. [2] A.Jose, et al., Rev Obstet Gynecol, 2011, 4 NO.1, 15-21. [3] A.Burges, et al., Dtsch Arztebl Int, 2011, 108(38), 635–41. [4] RF.Ozols, et al., Lancet, 2002, 360, 2086-2087. [5] SA.Cannistra, et al., N Engl J Med, 2004, 351, 2519-2529. [6] F.A.Raja, et al., Ann Oncol 2012, 23 118–127. [7] KJ.Scanlon, et al., Cancer Commun, 1990, 2(10), 339-343. [8] R. Metzger; et al. J. Clin. Oncol. 1998, 16, 309-316. [9] D.Cardinale, et al., PNAS USA, 2011, 108 (34), 542-549. [10] CP.Leamon, et al., Advanced Drug Delivery Rev, 2004, 56, 1127-1141. [11] E.Basal, et al., Plos One, 2009, 4, 1-7. [12] N.Parker, et al., Analitic Biochem, 2005, 338, 284–293. [13] M.Figini, et al., Gene Therapy, 2003, 10, 1018–1025.

Ovarian Cancer (OC) is the fifth most common cause of death from cancer in women and the most lethal of all gynaecologic malignancies [1-3]. Resistance to the standard chemotherapy [4-6] often rapidly occurs and human thymidylate synthase (hTS) over-expression seems to be one the major mechanisms involved [7]. Since hTS is an enzyme of the folate metabolic pathway that catalyzes a fundamental precursor of DNA synthesis, it became a drug target for several clinically relevant anti-cancer drugs, such as raltitrexed, pemetrexed and the pro-drug 5-fluorouracil [8]. Recent studies on peptides specifically designed to interact with the monomer–monomer interface of the enzyme (LR and its analogues), enlightened a novel mechanism of TS inhibition, since they stabilize the dimeric inactive form of the protein and inhibit cancer cell growth, without contemporary causing TS overexpression [9]. During my PhD work I tested the [DGln4]LR derivative, observing that it has a significantly enhanced biological activity compared to the lead peptide LR, although showing a similar behaviour in ovarian cell lines (M.Pelà et al., J Med Chem under revision).The specific mechanism of action of these peptides on ovarian cancer cell lines has not yet been clarified and is currently under evaluation. To study the mechanism of action of the peptides whole cells proteomic analysis has been performed. I have contributed to confirm the modulation of proteins profile after the treatment with these peptide, which has been identified by the proteomics and bioinformatics combined study (F.Genovese at al., manuscript in preparation). Taking advantage of fluorescence microscopy, I observed the peptide distribution within the cells, which seems to be preferentially localized in the cytoplasm. Next, to improve the delivery of the peptides, a novel pteroyl-nonapeptide conjugate (FA-LR) has been designed to enter cancer cells by FR-mediated endocytosis. Indeed, the alpha isoform of folate receptor (FR) is a tumour-associated glycosylphosphatidylinositol-anchored protein that is over-expressed in more than 90% of human non-mucinous ovarian carcinomas. Moreover, it binds folic acid (FA) with extremely high affinity and it was demonstrated to efficiently internalize both FA analogues and folate-conjugated molecules [10] With the aim of identifying the most suitable cellular models for testing our newly designed FA-conjugated peptides, I performed both quantitative and semi-quantitative assays to evaluate the expression levels of FR in a panel of human OC cell lines [10-13]. Preliminary substrate specificity studies showed that the FA-LR conjugate competes with the uptake of [³H]folic acid in FR-expressing cells (G.Marverti et al., manuscript in preparation). The assessment of pteroate-nonapeptide conjugate effects on cell growth, as well as the study of the efficiency of the folate receptor-targeted strategy by fluorescence microscopy, are currently under evaluation. This work is supported by the IG grant AIRC 2010 “TARGETING OVARIAN CANCER DRUG RESISTANCE”. [1] E.Weiderpass, et al., Saf Health Work, 2012, 3, 166-80. [2] A.Jose, et al., Rev Obstet Gynecol, 2011, 4 NO.1, 15-21. [3] A.Burges, et al., Dtsch Arztebl Int, 2011, 108(38), 635–41. [4] RF.Ozols, et al., Lancet, 2002, 360, 2086-2087. [5] SA.Cannistra, et al., N Engl J Med, 2004, 351, 2519-2529. [6] F.A.Raja, et al., Ann Oncol 2012, 23 118–127. [7] KJ.Scanlon, et al., Cancer Commun, 1990, 2(10), 339-343. [8] R. Metzger; et al. J. Clin. Oncol. 1998, 16, 309-316. [9] D.Cardinale, et al., PNAS USA, 2011, 108 (34), 542-549. [10] CP.Leamon, et al., Advanced Drug Delivery Rev, 2004, 56, 1127-1141. [11] E.Basal, et al., Plos One, 2009, 4, 1-7. [12] N.Parker, et al., Analitic Biochem, 2005, 338, 284–293. [13] M.Figini, et al., Gene Therapy, 2003, 10, 1018–1025.