Riassunto analitico
Nel trattamento del carcinoma ovarico, una delle principali cause di morte per tumore ginecologico nelle donne dei paesi occidentali, la timidilato sintetasi (hTS) può essere considerata un importante bersaglio farmacologico, poiché durante la terapia convenzionale, si sviluppa spesso farmacoresistenza con aumento dell'espressione di hTS. Grazie allo sviluppo delle biotecnologie farmaceutiche si assiste ad un progressivo aumento dell’interesse nei confronti dei farmaci peptidici come agenti terapeutici sito-specifici. Recentemente sono stati sintetizzati alcuni composti octapeptidici capaci di ridurre la crescita di cellule tumorali inibendo l’hTS. Tuttavia, come per tutti i farmaci peptidici, la loro efficacia può essere limitata dall'idrofobicità delle membrane cellulari. L'utilizzo di sistemi di veicolazione, in grado di mantenere inalterata la struttura e l'attività dei peptidi e di permetterne l'internalizzazione nelle cellule tumorali, rappresenta quindi una potenziale strategia terapeutica. Vettori lipidici, quali nanoparticelle solide lipidiche (SLN) e Liposomi, rappresentano carrier ideali per la veicolazione di farmaci chemioterapici, essendo biocompatibili, biodegradabili, versatili e in grado di sfruttare l’"enhanced permeability and retention effect" (EPR) per accumularsi nei tessuti tumorali.
La presente Tesi di Dottorato ha avuto lo scopo di progettare, sviluppare e confrontare tali carrier lipidici (SLN e Liposomi). Il lavoro è stato articolato nelle seguenti quattro fasi:
1) Sviluppo di SLN mediante una innovativa tecnica di emulsione multipla in assenza di solventi organici. SLN con dimensioni <150nm e buona stabilità alla liofilizzazione sono state formulate in presenza e in assenza di squalene. L’analisi del ciclo cellulare ha evidenziato un aumento di apoptosi nelle cellule trattate con SLN caricate con il peptide, dimostrando la capacità del carrier lipidico di incorporare e veicolare il composto idrofilico in modo efficace.
2) Sviluppo di Liposomi convenzionali e Liposomi pH sensibili. Sono stati preparati campioni con dimensioni <200nm e con buona efficienza d’incapsulazione, quantificata mediante cromatografia liquida accoppiata a spettrometria di massa (LC-MS/MS). La pH sensibilità dei Liposomi è stata valutata in vitro ed è risultata una caratteristica importante per avere un effetto biologico maggiore, rispetto ai liposomi convenzionali.
3) Sviluppo di Liposomi PEGilati pH sensibili. Alla formulazione ottimizzata di Liposomi pH sensibili sono stati aggiunti fosfolipidi PEGilati così da ottenere Liposomi "stealth". Studi d’interazione di questa formulazione con il siero hanno mostrato una minima formazione di protein-corona. Inoltre, tali Liposomi hanno dimostrato in vitro una scarsa tendenza all'internalizzazione in cellule macrofagiche, dimostrando quindi una maggiore capacità, rispetto agli omologhi non PEGilati, di poter raggiungere in vivo il tessuto tumorale.
4) Ottimizzazione del caricamento nei Liposomi pH sensibili PEGilati. La formulazione finale ottimizzata è stata testata su varie linee cellulari di tumore ovarico valutandone l’efficacia sia mediante studi di citotossicità che di modulazione proteica con Western Blot. Infine è stato dimostrato l’effetto sinergico dei Liposomi con altri farmaci antitumorali utilizzati in terapia, mimando un possibile protocollo terapeutico.
In conclusione è stato dimostrato come piccole molecole petidiche idrofiliche possano essere veicolate e direzionate efficacemente utilizzando carriers lipidici biocompatibili quali SLN e Liposomi. I Liposomi si sono dimostrati più versatili e ingegnerizzabili, consentendo di ottenere una formulazione ottimizzata promettente per il trattamento del carcinoma ovarico farmaco-resistente.
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Abstract
In the field of Ovarian Cancer, one of the most common causes of death from gynaecologic cancer in women in the Western world, human thymidylate synthase (hTS) can be considered a very interesting molecular target. Indeed, resistance to the standard cis-Platin chemotherapy often occurs rapidly and one of the mechanisms involved was an hTS over-expression. Since the advent of biotechnology over the last few decades, peptides have garnered much attention as therapeutic agents because of their specificity of action and the possibility of addressing the underlying causes of diseases. Recently, specific octapeptides able to reduce the growth of platinum-resistant cells by inhibiting hTS have been identified. However, the hydrophobic environment of the phospholipid cellular membrane limits their efficacy. Appropriate delivery vectors are necessary and should provide a long half-life, maintain the biological activity and stability of the peptide, target it to the tumour site, promote the uptake into the cancer cells, and successfully release the peptide to the cell cytoplasm.
Based on these criteria, biocompatible lipid nanocarriers, such as solid lipid nanoparticles (SLN) and Liposomes, are considered suitable vectors for anticancer agent transport, since their advantageous size allows them to be sequestered by tumour cells due to the enhanced permeability and retention effect (EPR).
The project of this PhD thesis aims to design, develop and compare these two kinds of lipid nanovectors in terms of ability to transport anti-hTS peptides into the cells.
The research work involved four steps, as follows:
1) Development of SLN with an innovative water-in-oil-in-water double emulsion method avoiding use of organic solvents. SLN formulated in absence/presence of small amount of squalene oil showed size below 150nm and good stability to the freeze-drying process. From the cell cycle analysis SLN-peptide treated cancer cells showed an increase of apoptosis percentage, indicating that SLN were able to deliver efficiently the peptide up to its enzymatic target.
2) Development of standard Liposomes along with pH sensitive Liposomes. Both formulations displayed size about 200nm and good drug encapsulation efficiency, quantified by liquid chromatography coupled with mass spectrometry. The pH sensitivity feature of Liposomes was demonstrated in vitro and the higher efficacy of the pH sensitive formulation over the standard one was highlighted by studies on ovarian cancer cells.
3) Using the better result from pH sensitive Liposomes, PEGylated phospholipids were employed to obtain “stealth” Liposomes. Studies of interaction with serum and with macrophages showed the ability of PEGylated pH-sensitive Liposomes to avoid not only the formation of the protein-corona but also the capture by macrophages, demonstrating a greater chance to reach the tumour tissue.
4) As final step, PEGylate pH sensitive Liposomes, with optimized drug loading, were tested in several ovarian cancer cell lines, and the peptide effectiveness was evaluated by cytotoxic assay and by Western Blot analysis. Synergistic or antagonist effect of the peptide-loaded Liposomes co-cultured with other anticancer drugs was also evaluated using various combinations, miming possible therapy protocols.
In conclusion two biocompatible lipid nanocarriers were developed and both carriers resulted effective in delivering hydrophilic peptide inside the cells, maintaining peptide structure and function on account of the formulation techniques employed. In particular, Liposomes resulted the most versatile carrier, indeed, the final optimized formulation can be considered promising for the treatment of multidrug-resistant ovarian cancer.
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