Riassunto analitico
La spettrometria di massa (MS) è diventata una delle tecniche maggiormente impiegata in diversi campi della ricerca scientifica. In particolare rappresenta il metodo elettivo per la caratterizzazione di complessi sistemi biologici. Con l’ introduzione delle tecniche di ionizzazione soft è stato poi possibile accoppiare lo spettrometro di massa con i più comuni strumenti di separazione come la high performance liquid chromatography (HPLC). Questo ha portato a beneficiare dell’ elevato potere risolutivo dell’ HPLC insieme alla sensibilità della spettrometria di massa. Il risultato è stato un aumento del range degli analiti da poter separare e analizzare permettendo la caratterizzazione di complesse matrici biologiche. Questa tesi è un esempio delle diverse possibili applicazioni dell’ accoppiamento della spettrometria di massa con l’ HPLC per lo studio di molecole biologicamente attive in matrici biologiche. In particolare, diversi metodi LC-MS/MS sono stati sviluppati e validati per: - Identificare e quantificare neurotrasmettitori e xenobiotici in microdializzati cerebrali di topo. Essendo questi presenti in basse concentrazioni, la loro identificazione e quantificazione richiedono metodi analitici sensibili e selettivi. Combinando la tecnica della microdialisi con LC-MS è stato possibile monitorare i livelli basali dei costituenti chimici dello spazio extracellulare in campioni di dializzato cerebrale di topo. Inoltre, il metodo analitico sviluppato è stato applicato per valutare l’ effetto dell’ iniezione intraperitoneale del 7-chloro-5-(3-furanyl)-3-methyl-4H-1,2,4-benzothiadiazine 1,1-dioxide, un modulatore allosterico positivo del recettore AMPA sul rilascio di neurotrasmettitori come Acetilcolina, Dopamina e Serotonina. Sono poi state determinate le concentrazioni del composto in esame e dei suoi metaboliti simultaneamente alle variazioni di concentrazione dei neurotrasmettitori negli stessi campioni. In questo modo sono state ottenute informazioni sulla farmacocinetica del composto in esame nella regione target a livello cerebrale che ha permesso di valutare il rapporto farmacocinetica/farmacodinamica comparando l’ andamento delle concentrazioni nel tempo del composto rispetto a quella dei suoi biomarker. - Studiare la stabilità chimica e configurazionale di composti farmacologicamente attivi. In particolare è stata valutata la stabilità chimica e configurazionale di un modulatore allosterico positivo del recettore AMPA a struttura benzotiadiazinica in condizioni che simulano l’ ambiente in vivo che il composto incontrerebbe quando somministrato.
- Identificare I possibili prodotti di degradazione e quantificare le concentrazioni intracellulari di un octapeptide in grado di inibire l’ attività della Timidilato Sintasi quando testato su cellule di cancro ovarico per valutarne l’ attività in vitro. In studi preliminari il peptide è stato portato all’ interno delle cellule utilizzando un sistema di delivery commercialmente disponibile, sfortunatamente non essendo un meccanismo fisiologico tale sistema non può essere utilizzato per successivi studi in vivo. Per ovviare a questo inconveniente è stato sintetizzato un coniugato del peptide con l’ acido folico. In questo modo il coniugato è stato veicolato all’ interno delle cellule per endocitosi mediata dal recettore FOLR1. Per studiare l’ internalizzazione, quantificare il peptide e valutare la sua stabilità nelle cellule e nel medium cellulare è stato sviluppato un metodo LC-MS/MS. L’ obbiettivo è stato quello di valutare se la coniugazione con il residuo dell’ acido folico potesse rappresentare una strategia efficace per veicolare il composto nelle cellule.
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Abstract
Mass spectrometry (MS) has become one of the most employed analytical techniques in different fields of science. In particular, It represents a method of choice in characterizing complex biological systems. With the introduction of soft ionization techniques it was possible to couple MS with the most common separation instrumentations like high performance liquid chromatography (HPLC). Thus lead to benefit of high resolution separation of HPLC together with highly sensitivity of MS. This resulted in the enlargement of the range of detectable analytes permitting the characterization of complex biological matrixes.
This thesis is an example of the various applications of LC-MS for the study of bioactive molecules in different biological matrixes. In particular different LC-MS/MS methods have been developed and validated for:
- The detection and quantification of neurotrasmitters and xenobiotics in mice brain microdialysates. Due to the their low levels, sensitive and selective analytical methods are required. Combining a microdialysis technique with LC-MS it was possible to monitor low basal levels of chemical constituents of extracellular space in living systems. Furthermore the LC-MS/MS method has been applied to evaluate the effect of intraperitoneal administration of 7-chloro-5-(3-furanyl)-3-methyl-4H-1,2,4-benzothiadiazine 1,1-dioxide, a positive modulator AMPA receptor, on the release of Acetylcholine, Dopamine and Serotonin. Concentrations of the administered drug and its possible metabolites were evaluated in the same microdialysates samples. The time course of free drug in the targeted brain region provided a biophase pharmacokinetic information which was used to evaluate pharmacokinetic/pharmacodynamic relationship by comparing the time course of free drug versus biomarkers.
- performing studies on configurational and chemical stability of pharmaceuticals. In particular stereo and chemical integrity of the previously described AMPA positive allosteric modulator under conditions which simulate in vivo environment.
- elucidating degradation products and quantifying intracellular concentration of peptides able to inhibit human Thymidylate Synthase enzyme, when they are applied to cell lines to test their pharmacological in vitro activity. For preliminary studies the peptides were delivered inside ovarian cancer cells using a commercially available delivery system, unfortunately it cannot be used for in vivo studies because it is not a physiological mechanism. To overcome this inconvenience, a pteroyl-peptide coniugate was synthetized. It was delivered inside ovarian cancer cells by FOLR1-mediated endocytosis. To investigate the internalization and to quantify the peptide and its stability in cells and cultural medium an LC-MS/MS method has been developed.The aim of this strategy was to verify whether the conjugation of a known TS inhibitor with a folic acid residue could represent an effective strategy to deliver the drug inside cancer cells.
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