Riassunto analitico
I metodi computazionali giocano un ruolo sempre più importante nella progettazione del farmaco. Lo screening virtuale (SV) è uno strumento potente per l'identificazione di composti attivi. Durante il dottorato ho studiato ed applicato metodi computazionali volti alla scoperta di potenziali farmaci. In particolare ho lavorato nel campo emergente della polifarmacologia. Molti farmaci esercitano il loro effetto terapeutico interagendo con bersagli multipli (es. molti farmaci usati nella terapia del cancro e delle patologie del sistema nervoso centrale). La capacità di progettare piccole molecole con un profilo di attività predefinito è un obiettivo attraente ed impegnativo. Ho lavorato alla messa a punto di un protocollo computazionale di polifarmacologia su Hsp90, un bersaglio rilevante per la terapia del cancro. Hsp90 è un chaperone molecolare con un vasto interattoma di cui fanno parte diversi bersagli validati per la terapia del cancro. L'obiettivo principale è stato la selezione di combinazioni di bersagli adatte per la progettazione di inibitori duali e di molecole candidate per la duplice attività. Le informazioni depositate in banche dati molecolari è stata ampiamente analizzata per la determinazione di combinazioni promettenti di bersagli costituite da Hsp90 ed un interattore. Lo SV basato sui ligandi, comprendente calcoli di ricerca per similarità e macchine a vettori di supporto, condotto sulle banche dati ChEMBL e ZINC è stato effettuato nel corso di un periodo che ho trascorso nel laboratorio del Prof. Jürgen Bajorath a Bonn. Sono state costituite una libreria di composti ChEMBL ed una di composti ZINC per ciascuna combinazione di bersagli. Successivamente uno SV basato sulla struttura dei bersagli è stato effettuato utilizzando programmi di docking (AutoDock4, Glide) e processamento post-docking (BEAR). Cinque composti ChEMBL e sette composti ZINC sono stati selezionati per i saggi biologici. Due composti attivi sono stati identificati nella libreria ZINC Hsp90-B-Raf. Un nuovo SV è stato effettuato per espandere le molecole attive e selezionare nuovi candidati. Ventinove composti sono stati infine selezionati. I risultati ottenuti sono riportati e discussi in questa tesi. Ho valutato l'impatto del processamento post-docking nell'identificazione di antagonisti noti di recettori accoppiati a proteina-G (GPCR) in un insieme più ampio di decoy molecolari. Le GPCR sono bersagli rilevanti e recenti progressi nella cristallografia stanno aprendo nuove prospettive per la progettazione di farmaci. Nonostante il loro successo è noto che i programmi di docking possono risultare inaccurati nella valutazione dell'energia di legame. Ho confrontato le prestazioni di AutoDock4 con un metodo di processamento post-docking (BEAR). Sono state studiate quattro GPCR: il recettore adrenergico beta-2, il recettore per l'adenosina A2a, il recettore della dopamina D3 ed il recettore dell'istamina H1. I risultati ottenuti hanno confermato AutoDock4 come strumento utile per la previsione di modalità di legame. D'altra parte l'applicazione di una funzione di scoring più accurata come MM-PBSA può migliorare il fattore di arricchimento dello SV. E' stata presentata inoltre una prospettiva sulla progettazione di molecole con bersagli multpli osservando il successo del metodo studiato nel classificare in posizioni elevate gli antagonisti condivisi da due differenti GPCR nei rispettivi SV. Lo stesso metodo di SV è stato applicato nella ricerca di inibitori allosterici della chinasi ciclina-dipendenti 2 (CDK2). CDK2 è coinvolta nel controllo del ciclo cellulare ed è un bersaglio validato nella terapia del cancro. Una libreria commerciale di 600.000 composti e stata processata tramite docking e post-docking. Trentacinque composti sono stati scelti per i saggi biologici e 7 di questi sono risultati attivi a livello micromolare in saggi su proteina e linee cellulari modello.
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Abstract
Nowadays, computational methods are playing an increasingly important role in drug discovery. As a matter of fact, virtual screening (VS) is a powerful tool for the identification of novel hit compounds. During my doctorate thesis, I studied and applied computational methods aiming at the discovery of potential drugs. In particular, I worked in the emerging field of polypharmacology. Many drugs elicit their therapeutic effect through the simultaneous modulation of multiple targets (e.g. cancer and central nervous system drugs). The ability to rationally design small molecules with a predefined multi-target activity profile is a highly attractive and challenging task. As a major part of my thesis, I worked on the set up of a computational polypharmacology VS protocol targeting Hsp90, a relevant target for cancer therapy. Hsp90 is a molecular chaperone interacting with many validated targets for cancer therapy. The main goal of my work was the identification of suitable target combination for dual-target inhibitor design and the identification of candidate compounds for dual activity. The information deposited in molecular databases regarding single and multi-target known inhibitors of Hsp90 and its interactome was extensively analysed. A set of promising target combinations made up by Hsp90 and an interactor was identified. The ligand-based VS part of the work including similarity search and support vector machines calculations on ChEMBL and ZINC databases was carried out during a six months period that I spent in the laboratory of Prof. Jürgen Bajorath in Bonn. Then, analysing the rankings, a ChEMBL and a ZINC compound library was built for each target combination. After the ligand-based work, extensive structure-based VS was subsequently carried out by using docking (AutoDock4, Glide) and post-docking processing (BEAR). Five ChEMBL and seven ZINC compounds were selected for biological assays. Two active compounds were identified in the Hsp90-B-Raf ZINC library. Following the results obtained a new ligand- and structure-based VS round was carried-out aiming at hit expansion and selection of new candidates. Twenty-nine compounds were finally selected for biological assays. The results obtained in this VS campaign are here reported and discussed. As for VS methodologies, I assessed the performance of post-docking processing in the identification of G-protein coupled receptor (GPCR) known antagonists among a larger set of molecular decoys. GPCRs are relevant targets and recent advancements in crystallography are opening new perspectives for structure-based drug design. Despite their success, it is a known fact that docking programs may prove inaccurate when comes to binding energy evaluation. To address this issue, I compared the performance of AutoDock4 with a post-docking processing method developed in the laboratory (BEAR). Four GPCRs were studied: beta2 adrenergic, adenosine A2a, dopamine D3 and histamine H1 receptors. The results obtained confirmed AutoDock4 as a useful tool for the correct prediction of binding modes. On the other hand, the application of a more accurate scoring function such as MM-PBSA can improve the VS enrichment factor. Furthermore, a perspective on multi-target drug design was put forward by successfully checking the ability of the studied method to rank at high positions antagonists shared by two different GPCR in the respective VS. The same VS method was also applied to perform a VS campaign aiming at the identification of cyclin-dependent kinase 2 allosteric inhibitors (CDK2). CDK2 is involved in the control of the cell cycle and is a validated target in cancer. Docking and post-docking with BEAR of a commercial library of 600,000 compounds was carried out. After visually inspecting the best scoring complexes, 35 candidates were selected for biological assays and 7 of them proved to be active in the micromolar range toward both isolated protein and breast cancer cell lines.
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