Riassunto analitico
Durante il mio Dottorato di Ricerca, sono stato coinvolto in tre progetti, aventi come obiettivo a) l’identificazione di inibitori non β-lattamici come potenziali agenti anti-infettivi; b) la selezione di modulatori della proliferazione e differenziazione di cellule staminali; c) l’ottimizzazione di composti peptidici per il trattamento del tumore ovarico. In particolare, a) ha rappresentato il principale focus di ricerca mentre b) e c) sono stati sviluppati in modo meno estensivo.
a) I microorganismi produttori di β-lattamasi rappresentano alcuni dei più aggressivi agenti patogeni responsabili di molte infezioni farmaco-resistenti. Particolarmente rilevanti sono le β-lattamasi ad ampio spettro, in grado d’idrolizzare anche gli antibiotici di ultima generazione [1]. All’interno del progetto FP7 OPTObacteria sono state selezionate alcune delle β-lattamasi piú rilevanti dal punti di vista clinico, per le quali mi sono occupato della messa a punto della procedura di purificazione e della caratterizzazione cinetica. Un database commerciale di circa 200.000 molecole è stato studiato mediante approcci computazionali di structure-based virtual screening nei confronti delle β-lattamasi selezionate allo scopo d’identificare nuovi potenziali inibitori. Le molecole più interessanti, sono state acquistate e testate in saggi biochimici per valutarne l’effettiva attivitá. Il profilo di inibizione dei composti nei confronti delle varie β-lattamasi è stato valutato mediante un saggio colorimetrico automatico in modalità “medium-high throughput screening”. I valori di IC50 e Ki sono stati calcolati. I composti più promettenti sono stati ancorati alla superficie di opportune fibre ottiche allo scopo di produrre tools diagnostici per la rilevazione, in campioni biologici, di enzimi β-lattamici quali biomarkers di resistenza batterica.
b) Le proteine hYAP1 and hTEAD4 sono gli effettori terminali della cascata chinasica Hippo pathway, responsabile dell’attivazione della proliferazione e della differenziazione cellulare di cellule staminali. In particolare, il complesso dimerico YAP-TEAD è stato riconosciuto come un potenziale target per lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici anticancro e per applicazioni di medicina rigenerativa [2]. Nell’ambito del progetto Novamolstam, mi sono personalmente occupato della determinazione delle condizioni sperimentali ottimali per l’espressione eterologa di entrambe le proteine in ospiti batterici, e della loro purificazione. Una libreria in house di potenziali inibitori della formazione del complesso YAP-TEAD è stata selezionata, per i quali ho progettato un saggio biochimico basato sulla fluorescenza al fine di determinarne l’effetto inibitorio. I risultati ottenuti sono ancora preliminari ma promettenti. La citotossicità e l’attività biologica dei composti selezionati sono state anche valutate mediante un saggio reporter a livello cellulare.
c) La Timidilato Sintasi umana (hTS) è un enzima omodimerico coinvolto nella sintesi del DNA, spesso sovraespresso nelle cellule di tumore ovarico. Nuovi composti peptidici in grado di legare specificamente l’interfaccia dimerica dell’enzima sono stati progettati e coniugati con sonde fluorescenti e acido folico in modo da monitorarne il processo di internalizzazione cellulare [3]. Mi sono occupato della purificazione e della caratterizzazione del profilo cinetico dell’enzima, ho eseguito i saggi di inibizione dei composti peptidici sintetizzati mediante saggio spettrofotometrico, determinandone i valori di IC50 e Ki. Nuovi potenziali inibitori di hTS sono stati identificati.
REFERENCES
[1] Farina D. et al.; Curr Med Chem, 2014, PMID:24180276;
[2] Santucci M. et al.; J Med Chem, 2014, PMID:25719868;
[3] Pelà Michela et al.; J Med Chem, 2014, PMID:24450514.
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Abstract
During my PhD, I was involved in three main medicinal chemistry projects, a) the discovery and characterization of non beta-lactam inhibitors to counteract antimicrobial resistance, b) the identification of chemical compounds modulating the proliferation and differentiation of stem cells and c) of peptide-based compounds for ovarian cancer treatment. The primary issue concerns the identification and characterization of non β-lactam inhibitors as new potential anti-infective agents. The arguments b) and c) were studied in a less extensive manner.
a) β-lactamases (BLs) expressing pathogens represent some of the most aggressive microorganisms responsible for many resistant infections. Of particular clinical relevance are the extended-spectrum beta-lactamases (ESBLs), for which the classic β-lactam-based inhibitors are almost completely ineffective [1]. Within the FP7 OPTObacteria project some of the most relevant β-lactamases were selected and I was specifically involved in setting up and performing the purification and the kinetic characterization for each of them. A commercial database of about 200.000 molecules was screened with a Structure-based Virtual Screening approach towards the selected β-lactamases. The most interesting molecules were purchased and tested for inhibition in biochemical assays. I evaluated the biochemical inhibitory profile of the compounds against the purified BLs set by an automated high-medium throughput assay, through IC50 and Ki values determination. Some of the most promising inhibitors were used to chemically functionalize the surface of optical probes (LPG) to be used as diagnostic tools for the detection of β-lactamases, as biomarkers of resistant microbial infections in biological samples.
b) The hYAP1 and hTEAD4 proteins are the terminal effectors of the Hippo pathway, an emerging signaling cascade in human stem cells biology, responsible for the activation of the promoting-proliferation genes transcription. In particular, the YAP-TEAD dimer complex has been recognized as a very attractive target for the development of new cancer therapeutics and of regenerative medicine applications [2]. I set up the optimal conditions for their ectopic expression in bacterial host and for their purification procedure, achieving a purity grade >>95%. An in house library of potential inhibitors of the YAP-TEAD complex formation has been collected. I am personally taking care of setting up a fluorescence-based biochemical assay to perform the screening. The cytotoxicity and biological activity of the compounds will be further studied by gene reporter assay to identify the most promising inhibitors of dimer complex.
c) Human Thymidylate Synthase (hTS) is a homodimeric enzyme playing a key role in DNA synthesis and it is overexpressed in Ovarian Cancer cells (OC). New peptide-based compounds able to specifically target the dimer interface of hTS have been designed. They were also conjugated with fluorescent probes and folic acid to monitor the cellular internalization and to specifically target the folic receptor transportation in overexpressing OC cells [3]. I was involved in hTS protein purification and kinetic characterization. I also performed enzyme inhibition assays by spectrophotometric method to determine the IC50 and Ki values of each synthesized peptide. Promising optimized inhibitors of hTS target protein have been identified.
REFERENCES
[1] Farina D. et al.; Curr Med Chem, 2014, PMID:24180276;
[2] Santucci M. et al.; J Med Chem, 2014, PMID:25719868;
[3] Pelà Michela et al.; J Med Chem, 2014, PMID:24450514.
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