Riassunto analitico
Il progetto ha lo scopo di analizzare i meccanismi molecolari che regolano la selezione del follicolo dominante e di determinare il ruolo del recettore FSHR dell'ormone follicolo-stimolante (FSH) e del recettore accoppiato a proteina G degli estrogeni (GPER) durante il ciclo ovarico. FSHR e GPER sono recettori accoppiati a proteine G (GPCRs) presenti nelle cellule della granulosa e sono rispettivamente target di FSH e dell’ormone steroideo estradiolo (E2). L’ipotesi, sulla quale sono stati svolti gli esperimenti, si basa sulla possibile interazione e dimerizzazione tra FSHR e GPER, al fine di comprendere i meccanismi molecolari che regolano la sopravvivenza cellulare e la selezione del follicolo dominante.
Negli esperimenti sono state utilizzate cellule primarie della granulosa umane lutenizzate (hGLC), che esprimono FSHR e GPER, e cellule HEK293 (Human Embryonic Kidney 293), nelle quali i recettori sono stati espressi mediante trasfezione. La localizzazione dei recettori sulla membrana cellulare è stata osservata mediante microscopio confocale e con saggi di immunofluorescenza, mentre la dimerizzazione tra FSHR e GPER è stata valutata mediante BRET. Attraverso il confronto con un recettore mutato (GPER-mut), il quale non forma un eterodimero con FSHR, è stata valutata la specifica interazione tra i recettori e sono state analizzate le diverse vie di trasduzione del segnale attivate dai recettori. Per comprendere i meccanismi molecolari che regolano la selezione del follicolo dominante sono stati esaminati, dopo il trattamento con FSH, i livelli intracellulari di cAMP, mediante BRET, in cellule HEK293 esprimenti FSHR e/o GPER e in hGLC trattate con siRNA GPER. Inoltre sono stati valutati i livelli intracellulari di Ca2+, in cellule HEK293 esprimenti GPER, dopo trattamento con E2. L’analisi della vitalità cellulare, mediante MTT, ha mostrato una differente vitalità cellulare in base ai recettori espressi e, mediante western blotting, sono state osservate le bande corrispondenti alle molecole pCREB e pAKT, che regolano i processi di apoptosi, steroidogenesi o sopravvivenza cellulare. Gli esperimenti hanno permesso di comprendere come GPER possa dimerizzare con FSHR e di conseguenza modificare i segnali intracellulari che regolano l’apoptosi cAMP-mediata. Infatti, le cellule in cui si è verificata l’eterodimerizzazione dei recettori hanno mostrato un livello di cAMP intracellulare minore, ma una vitalità cellulare superiore. I risultati ottenuti hanno quindi portato a ipotizzare che la dimerizzazione tra FSHR e GPER possa inibire la produzione di cAMP attraverso il legame del complesso proteico MAGUK/AKAP5 di GPER con la proteina Gαs del recettore di FSH.
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