Riassunto analitico
Le mucopolisaccaridosi sono patologie genetiche da accumulo lisosomiale, caratterizzate dalla mancanza di uno degli enzimi coinvolti nel catabolismo dei GAGs, che si accumulano così in cellule, tessuti e organi, promuovendo la loro disfunzione e la conseguente apparizione della sintomatologia clinica. Attualmente, l’efficacia della terapia enzimatica sostitutiva (ERT), somministrata ai pazienti affetti da MPS I,II e VI, viene valutata solo mediante osservazione del miglioramento dei segni clinici peculiari, o mediante analisi quantitativa dei GAGs urinari effettuata con generico saggio colorimetrico o elettroforesi su acetato di cellulosa. Questi approcci analitici permettono però solo di identificare modificazioni quantitative. Durante il mio lavoro di tesi sono state applicate procedure analitiche sensibili, che hanno permesso di caratterizzare, sia da un punto di vista quantitativo che qualitativo, i GAGs urinari e plasmatici in soggetti affetti da MPS I e II, prima e durante il periodo di ERT considerato. Lo studio condotto su due fratelli affetti dalla forma lieve di MPS I, ha mostrato la presenza, a livello plasmatico ed urinario, prima della terapia, di alte quantità di DS patologico ad alto peso molecolare (13000-13500), assente nei soggetti di controllo. Al termine della terapia, sia nel plasma che nelle urine è stato osservato un calo della quantità di GAGs totali, rispetto a quanto valutato prima dell’inizio della terapia. Da un punto di vista qualitativo invece, il profilo plasmatico, dopo 10 mesi di terapia, è paragonabile a quello dei soggetti di controllo, al contrario, a livello urinario, è stato riscontrato ancora DS patologico. Dopo la terapia, il DS patologico accumulato nel plasma scompare completamente, a dimostrazione dell’efficacia della terapia ERT. L’analisi dei GAGs urinari soggetto affetto da MPS II prima dell’ERT ha mostrato il 90% dei galattosaminoglicani presenti a livello urinario corrisponde a DS e non a CS fisiologico. Al termine della terapia, a livello urinario è stata riscontrata la presenza di DS patologico, che non viene quindi completamente rimosso in seguito a ERT. Al contrario però di quanto osservato nel plasma del soggetto affetto da MPS I, il paziente affetto da MPS II, presenta ancora nel plasma DS patologico, mostrando l’incapacità della terapia, di rimuovere completamente il DS patologico non solo a livello urinario ma anche a livello plasmatico. La variabilità osservata tra i pazienti afetti dallo stesso tipo o da differenti tipi di MPS, mostra la possibilità che l’efficacia della terapia possa subire variazioni da soggetto a soggetto. La differenza di risposta del paziente alla terapia, riscontrata nei pazienti affetti da MPS I e MPS II, può essere dovuta a diverse ragioni, che rappresentano possibili fattori di variabilità nell’azione della terapia stessa: grado di severità della malattia, durata della terapia ERT, differente attività dell’enzima ricombinante somministrato durante la terapia, differente risposta del soggetto alla terapia al quale è sottoposto, a causa di fattori di variabilità endogeni del soggetto stesso, differente risposta del soggetto alla terapia, a causa di fattori ambientali ai quali il paziente è sottoposto durante la propria vita. Le procedure analitiche, messe a punto in questo studio, possono rivelarsi molto utili al fine di monitorare l’andamento della terapia ERT in ciascun paziente, e di personalizzarne la cura in base alla risposta osservata. Non meno importante potrebbe essere l’utilizzo di queste metodiche analitiche per monitorare terapie alternative ed ipoteticamente più efficienti, per la cura dell’MPS I, II, ma anche di altri tipi di MPS
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Abstract
Mucopolysaccharidoses (MPS) are a group of inherited lysosomal storage disorders characterized by a deficiency in one of the lysosomal enzymes required to degrade glycosaminoglycans (GAGs). In all MPS subtypes, partially degraded GAG(s) accumulate in the lysosomes of affected cells and/or are eliminated in the blood and excreted in the urine. Enzyme-replacement therapy (ERT), has emerged as a new treatment for MPS disorders. In this study, we quantitatively and qualitatively analyzed high molecular mass GAGs present in the urine and plasma of our three clinically stabilized patients, affected by a severe form of MPS I and an attenuate form of MPS II, submitted to ERT, over a 10 months period compared with pretreatment analytical data. The defect of the two enzymes responsible for MPS I and II gives rise to the accumulation of the same high molecular mass GAGs, i.e., urinary and plasmatic DS and HS ( data showed by agarose gel electrophoresis). In fact, in the MPS I and II patients before ERT, urinary and plasmatic galactosaminoglycans, after chondroitinase ABC treatment, were mainly composed of ~90% Di4s, most corresponding to pathological DS, IdoA-rich material (data obtained by enzymatic treatment by chondroitinase B), opposed to physiological undersulfated CS present in plasma and CS in urine. A strong increase in the urinary and plasmatic pathologic polysaccharide percentage was measured immediately after the first enzyme infusion, followed by a continuous decrease in the 8–15 days following the beginning of treatment. After this, an almost constant content of the pathological DS was observed. We can suppose that immediately after the first enzyme administrations, a large amount of abnormal DS is removed from tissues reaching the blood compartment and eliminated via the urine, and thereafter only minimal changes have been observed. Plasma GAGs in MPS I subjects at the end of the period of therapy analyzed were found to be comparable to those of normal subjects, while a pathological high molecular mass DS was still found in the urine. Interestingly, a rather similar trend was observed in the plasmatic and urinary GAGs in our MPS II subject after several months of ERT evaluated in this study. In fact, after 10 months’ treatment, a high percentage (~40%) of DS was detected in the urine, and plasma still showed ~14% of IdoA-associated material.
ERT performed by infusion of recombinant human iduronidase to treat MPS I or iduronate-2-sulfatase for MPS II at the standard doses does not totally remove DS from urine and plasma in our MPS Patient, except for MPS II patient plasma, after prolonged treatment even if they are very effective in eliminating large amounts of this pathological GAG just after the first weeks following the beginning of enzyme infusion. Thus confirming the incomplete effectiveness of ERT at the present standard dose to maintain a constant level of physiological GAGs, as we qualitatively characterized still abnormal levels of the pathological polymer along with normally excreted CS in the urine. The different effect of ERT on MPS I and II patients plasma and the different quantitative DS profile in urine and plasma patients, during ERT period may be due to several reasons, such as different periods of treatment (10 months versus 6 years), therapy beginning and duration, MPS disease type, possible variable effects depending on the subjects, or environmental factors to which the patient is subjected during its life.
On the basis of these considerations, the present specific and sensitive measurements and structural characterization of human biological fluid gags, would be extremely helpful for an accurate evaluation of the kinetics of catabolic products to monitor the outcome of therapy ert or more effective and new therapeutic interventions in each patient, to create a personalized therapy based on the patient's response
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