Riassunto analitico
L’acido urico (UA) è uno dei prodotti finali del catabolismo nucleotidico nell’uomo: nel sangue la sua concentrazione varia nel range 140-480 µM e nell’essudato delle ferite nel range 220-750 µM. Alte concentrazioni di UA nel sangue possono essere associate a diverse condizioni patologiche e possono portare alla formazione di calcoli renali.
Questo metabolita inoltre può essere un indicatore di una infezione batterica nelle ferite. Il trattamento delle ferite cutanee rappresenta ad oggi un’importante problematica medica: le tecnologie associate al monitoraggio e alla cura delle ferite, il cui scopo è quello di raccogliere dati riguardo al loro stato di guarigione in ambito ospedaliero e domestico, sono una reale esigenza dal momento che rappresentano un mezzo di prevenzione dallo sviluppo di ferite croniche.
Batteri quali S. aureus e P. aeruginosa, che si trovano normalmente nelle ferite, possiedono una uricasi endogena, l’enzima deputato all’ossidazione dell’UA, e di conseguenza possono metabolizzare l’UA presente nella ferita. Una diminuzione dei livelli di UA nel fluido delle ferite, proporzionale alla carica batterica presente, può essere perciò indicatore di un’infezione. Un biosensore per l’UA integrato in un cerotto cutaneo può essere quindi potenzialmente un utile dispositivo medico.
Lo scopo finale di questa tesi è stato quello di sviluppare un biosensore per l’acido urico capace di monitorarne i livelli in soluzioni modello e in essudato artificiale. Per poter interfacciare il dispositivo elettronico ad un sistema biologico alcune delle sue componenti sono fabbricate con materiali organici e flessibili. L’utilizzo di molecole organiche permette di risolvere i limiti che si riscontrano nell’utilizzo di materiali inorganici rigidi: è possibile utilizzare dei substrati flessibili, sfruttare tecniche di fabbricazione semplici ed economiche (drop casting, spin coating, inj-jet printing) e di operare a bassi voltaggi.
Come base per il biosensore è stato scelto un transistor organico elettrochimico (OECT) stampato, flessibile e monouso. La selettività del biosensore è garantita dall’enzima uricasi immobilizzato sul dispositivo.
La reazione tra l’acido urico (l’analita target) e l’enzima (l’elemento di riconoscimento) porta alla formazione di perossido di idrogeno (H2O2). Quest’ultimo, secondo i principi di funzionamento di un OECT, è responsabile del segnale del dispositivo: questo segnale consiste nella variazione della corrente attraverso il canale costituito da un semiconduttore organico. Grazie a questa reazione, è possibile misurare indirettamente la concentrazione di UA tramite la rilevazione della concentrazione di H2O2.
Ai fini di sviluppare il biosensore, l’enzima uricasi è stato immobilizzato in una matrice di gelatina-A, costituita da un insieme di proteine idrosolubili derivate dal collagene, depositata sull’elettrodo di gate del transistor. Innanzitutto le misurazioni sono state svolte nel buffer PBS, in seguito gli stessi esperimenti sono stati effettuati utilizzando un essudato artificiale riprodotto in laboratorio contente alcuni dei componenti maggiormente presenti nei campioni reali di essudato.
In prospettiva, un dispositivo così sviluppato, una volta integrato in una medicazione per ferite, potrebbe potenzialmente restituire utili informazioni riguardo lo stato di guarigione delle ferite.
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Abstract
Uric acid (UA) is an end product in human purine nucleotides catabolism: UA concentration in blood naturally varies within the range of 140-480 µM and between 220-750 μM in wound fluid. High blood concentrations of uric acid can be associated with pathologic condition and can lead to the formation of ammonium urate kidney stones.
UA can be an indicator of a bacterial infection in skin wounds. Wound management represents nowadays a remarkable medical issue: wound care technologies, whose aim is to collect data about the wound status directly from the patient’s home, are a noteworthy and impelling need: they represent useful means of prevention from development of a chronic wound status.
S. aureus and P. aeruginosa bacteria, that are normally present in skin wounds, own their endogenous uricase therefore they can metabolize and consume uric acid in the wound environment. Therefore, decrease of uric acid levels in the wound fluid can be an indicator of a bacterial infection and it is proportional to the bacteria load. Thus, a uric acid biosensor integrated in a skin wound bandage would be a useful medical device.
The final aim of this thesis was to develop a uric acid biosensor able to monitor uric acid levels in aqueous samples. The device is made of organic materials so that it can interface with biological systems. Fabricating electronic devices with organic molecules allows to overcome drawbacks of inorganic materials: it is possible to use flexible substrates, to exploit simple and cost-effective fabrication techniques (e.g. solution casting, spin coating, ink-jet printing), to operate at low voltages.
For this purpose, the choice was a printed, flexible and disposable Organic ElectroChemical Transistor (OECT)-based biosensor. The sensor selectivity was guaranteed by the uricase enzyme immobilized on the device.
The reaction between uric acid (the target analyte) and the enzyme (the recognition element) leads to the formation of H2O2. The latter, according to the OECT working principle, is responsible for the device signal which consists in a current variation through the organic semiconductor channel. Accordingly, it is possible to indirectly evaluate uric acid concentration through the H2O2 detection.
To develop the biosensor, the uricase was immobilized in a gelatin-A (water-soluble collagen proteins) matrix deposited on the gate electrode. Firstly, measurements were performed in PBS buffer, then in artificial wound exudate simulant, which contains some of the most representative electrolytes and molecules found in real exudate samples.
In perspective, such a device, once embedded in a bandage, would potentially give information about the infection and healing status of the wound.
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