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Capitolo 1: Caratterizzazione elettrochimica dell’enzima CYP450 aromatasi immobilizzato su elettrodo d’oro.

Aromatasi è un citocromo P450 microsomiale, responsabile della conversione degli androgeni in estrogeni. La sintesi locale degli estrogeni da parte di aromatasi ha un ruolo importante nel promuovere la crescita di tumori al seno estrogeno-dipendenti. Ad oggi, tre sono gli inibitori di aromatasi approvati dalla FDA (anastrozolo, letrozolo e exemestano) in uso come trattamento di prima-linea in pazienti con tumore al seno ormone-dipendente o per tumori over-esprimenti tale enzima. Tuttavia, dato l’incremento del numero di pazienti resistenti alle terapie standard, è di continuo interesse l’identificazione di suoi nuovi inibitori. Come membro della famiglia dei CYP450, aromatasi presenta un centro catalitico costituito da un gruppo eme, a cui la citocromo P450 reduttasi fornisce gli elettroni necessari alla reazione. Nonostante i progressi compiuti nella determinazione delle relazioni tra la struttura e la funzione di aromatasi, non è ancora stato descritto il comportamento dell’enzima immobilizzato su elettrodo.
Scopo del lavoro di tesi è, dunque, la caratterizzazione elettrochimica dell’enzima aromatasi, nativo e in associazione con il suo substrato (androstenedione) e con il suo inibitore (anastrozolo), in seguito ad immobilizzazione su elettrodo d’oro funzionalizzato con un SAM di 100% MUA e di 50:50 MUA-MU. In questo modo, è l’elettrodo a svolgere la funzione di donatore-accettore di elettroni, consentendo di studiare il processo di trasferimento elettronico tramite esperimenti di voltammetria ciclica (CV). Lo stato conformazionale dell’enzima, la struttura del sito attivo e il legame substrato/inibitore, durante l’immobilizzazione, sono stati monitorati attraverso esperimenti di SERRS. Data l’importanza di aromatasi per la salute e l’interesse nell’identificazione di suoi nuovi inibitori, una sua caratterizzazione su elettrodo è centrale nella realizzazione di una piattaforma elettrochimica per lo screening high-throughput di nuovi candidati farmaci.

Capitolo 2: PDE5 umana: realizzazione di un sistema-modello basato sulla FRET.

La fosfodiesterasi 5 (PDE5) è l’enzima responsabile dell’idrolisi del cGMP a 5’-GMP. Il cGMP è un messaggero cellulare secondario con un importante ruolo in diversi processi fisio-patologici. Recentemente, diversi gruppi hanno riportato un aumento dell’espressione della PDE5 in diversi tumori quali colon, polmone, seno e melanoma. Quattro sono gli inibitori della PDE5 approvati dalla FDA (sildenafil, tadalafil, verdenafil, avalafil) prescritti come trattamento di diversi disordini e di recente è emerso un loro possibile uso anche nel meccanismo di sensibilizzazione delle cellule tumorali al trattamento chemioterapico. Data l’emergente importanza della PDE5 in diversi ambiti, numerosi sono gli studi per l’identificazione di nuovi composti in grado di inibirne l’attività. Attualmente vi sono pochi saggi disponibili in commercio per lo screening di ligandi/inibitori della PDE5, tutti basati sull’analisi indiretta di tale legame.
In questo lavoro di tesi è stato ideato un nuovo sistema modello per monitorare in maniera diretta il legame di inibitori al sito catalitico della PDE5. Tale modello prevede l’utilizzo della metodica di FRET, che permette di studiare interazioni intra- o intermolecolari a distanza ravvicinata (1-10 nm). Per fare ciò, è stato espresso il dominio catalitico della PDE5 ingegnerizzato in modo da poter essere coniugato al fluoroforo arseniato FlAsH. E’ stato inoltre ideato e sintetizzato un analogo strutturale del substrato coniugato a un fluoroforo accettore di FRET. Il sistema così progettato consentirebbe di compiere screening high-troughput di nuovi possibili inibitori.

Chapter 1: Electrochemical characterization of human CYP450 aromatase immobilized on gold electrode. Aromatase is a microsomal cytochrome P450 enzyme responsible for the synthesis of estrogens from androgens. In situ estrogen synthesis by aromatase is thought to play a key role in the promotion of estrogen-dependent breast cancer growth. Three FDA-approved AIs (anastrozole, letrozole and exemestane) have been used as first-line drugs in the treatment of hormone-dependent breast cancer, and possibly other aromatase-expressing cancers. However, because of the onset of patients resistant to standard therapy, it is central the identification of new aromatase inhibitors. As a member of CYP450 family, aromatase contains a heme as a prosthetic group. Upon receiving electrons from NADPH-cytochrome P450 reductase, aromatase converts androstenedione and testosterone to estrone and estradiol, respectively. Although significant progress has been made in the understanding of the structure–function relationship of aromatase, today it is still unclear its behavior on solid surfaces. Aim of this study is the electrochemical characterization of the CYP450arom enzyme, wild type or in complex with its substrate (androstenedione) or its inhibitor (anastrozole), after immobilization on a gold electrode coated with a SAM of 100% MUA and 50:50 MUA-MU. Under these conditions, the electrode function as the electron donor-acceptor, and the electron transfer of the redox center could be studied through voltammetric experiment (CV). In order to check the conformational state, the heme oxidation and spin states changes upon immobilization on the electrode and after substrate/inhibitor binding, SERRS experiments were performed. Given the importance of aromatase for human health and the interest in the identification of new inhibitors, an electrochemical characterization on solid surface would make the application of electrochemical methods a very attractive strategy for the construction of a reagent-less platform for high-throughput screening of new drug candidates. Chapter 2: Human Cyclic Nucleotide Phosphodiesterase 5: designing a new FRET-based study using the catalytic domain. PDE5 (cGMP-specific 3',5'-cyclic phosphodiesterase) catalyzes the hydrolysis of cGMP to 5’-GMP. cGMP is a second messenger that regulates proliferation, apoptosis and cellular differentiation, with an important role in many pathophysiological processes. Currently, the FDA has approved four PDE5-specific inhibitors (sildenafil, tadalafil, verdenafil and avalafil) that are clinically used to treat several disorders. Furthermore, it has been recently reported an increasing expression of PDE5 in various types of cancers (such as colon, lung, breast and melanoma), and the possibility to use PDE5 inhibitors in improving the sensitivity of certain cancer cells to standard chemotherapeutic drugs. Due to the emerging importance of PDE5 enzyme, numerous are the efforts for the identification of new inhibitors. To date, there are just few assays for the screening of PDE5-ligand/inhibitor, all based on the indirect analysis of the binding. In the thesis we present a new approach to monitor protein–inhibitor interaction using FRET technique, which is unique in providing signals sensitive to intra- and intermolecular distances in the 1–10 nm range. To do that, we expressed the catalytic domain of PDE5 conveniently engineered to be conjugated to the biarsenical fluorescein derivative FlAsH; moreover, we designed and synthetized a fluorescent substrate able to do FRET with the PDE5 catalytic domain. Once optimized the interaction between the enzyme and the substrate, this system could be an interest tool to use for the screening of new inhibitor molecules.