Riassunto analitico
I macrofagi svolgono ruoli cruciali nell'omeostasi tissutale e nell'immunità, in particolare nell'aterosclerosi sia nella formazione delle placche aterosclerotiche sia nei processi di trasporto cellulare del colesterolo. Alcune popolazioni macrofagiche possono influenzare il metabolismo sistemico modulando la tossicità epatica di xenobiotici e l'infiammazione epatica. Evidenze suggeriscono che la sfingosina-1-fosfato (S1P), un lisosfingolipide trasportato nel plasma dalle HDL, può agire come composto antiaterosclerotico attraverso specifici recettori GPCR (S1PR1, S1PR3) su cellule rilevanti per l’aterosclerosi, i macrofagi. Per caratterizzare gli effetti di S1P endogena, abbiamo generato modelli murini peculiari in grado di sovraesprimere S1PR1 o S1PR3 selettivamente nelle cellule mieloidi (monociti/macrofagi), basandosi sulla tecnologia Cre-LoxP. Altri modelli murini possono aiutare a studiare il ruolo dei macrofagi in ambito epatotossico e infiammatorio, generando lesioni epatiche (AILI) indotte da overdose di acetaminofene (APAP). Infatti, il SI può contribuire all'epatotossicità indotta da APAP e si è osservato che l'inibizione dell'attività macrofagica può bloccare significativamente questo fenomeno patologico. Abbiamo così investigato il ruolo del macrofago in ambito cardiovascolare e metabolico, concentrandosi sulla pathway di S1P e l'epatotossicità. Inizialmente, abbiamo studiato l'effetto dell'amplificazione del segnale S1P nei topi che sovraesprimessero S1PR1 o S1PR3 nei monociti/macrofagi. Poi, abbiamo generato e convalidato il modello murino AILI per studiare le funzioni dei macrofagi infiammatori nel fegato, in particolare per chiarificare le funzioni di quelli reclutati in contrasto con quelli residenti Kupffer Cells. La sovraespressione di S1PR1/S1PR3 nei macrofagi è stata ottenuta incrociando topi flox con topi in cui la Cre-ricombinasi viene espressa sotto il controllo del promotore del lisozima (Lyz), guidando l'espressione nella linea mieloide (topi S1PR1/3-Lyz). Tutti i modelli animali sono stati caratterizzati a livello molecolare e funzionale attraverso qPCR, WB e IF, utilizzando preparati di macrofagi peritoneali isolati da topi WT e S1PR1/3-Lyz. L'aterosclerosi è stata valutata in topi controllo e S1PR1-Lyz, entrambi su background LDLR -/-, suscettibili alla malattia in seguito all’assunzione di una dieta aterogena. Al sacrificio, sono stati analizzati sangue, organi interni e aorte per la valutazione istologica e dei marcatori infiammatori. L’estensione delle placche è stata valutata con la colorazione Oil-Red-O di radici aortiche e aorte intere. Riguardo al modello murino AILI, i topi C57BL/6 TLR4 flox sono stati messi a digiuno la notte prima della somministrazione di 250 mg/kg APAP mediante iniezione ip. I campioni di fegato e plasma sono stati ottenuti dopo almeno 24 h dall’iniezione per stimare la presenza di danno epatotossico. I modelli S1PR1/S1PR3-Lyz sono stati pienamente validati per la sovraespressione tessuto-specifica dei S1PRs a livello genico, proteico e funzionale. Abbiamo dimostrato che la stimolazione selettiva di S1PR1 da parte di S1P-endogena è in grado di ridurre drasticamente le lesioni aterosclerotiche. Il modello AILI è stato convalidato tramite colorazioni di H&E su criosezioni di fegato, il dosaggio delle ALT, la curva di sopravvivenza e l’analisi al citofluorimetro. In questo studio abbiamo validato nuovi modelli murini utili per valutare il ruolo del macrofago nella patologia cardiovascolare e metabolica. In particolare, abbiamo dimostrato per la prima volta che l'amplificazione del segnale S1P nei macrofagi riduce drasticamente le lesioni aterosclerotiche in vivo, probabilmente attraverso una modulazione dell’insulto infiammatorio associato.
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Abstract
Macrophages play crucial and distinct roles in tissue homeostasis and immunity. In particular, macrophages have a key role in atherosclerosis, leading to the formation of atherosclerotic plaques and facilitating the clearance of cholesterol. Peculiar macrophage populations may affect systemic metabolism by modulating hepatic toxicity of xenobiotics and liver inflammation. Recent evidence suggests that sphingosine-1-phosphate (S1P), a bioactive lysosphingolipid transported in plasma by HDL, may act as antiatherosclerotic compound acting through specific GPCR receptors, mainly type 1 and 3 (S1PR1, S1PR3) on atherosclerosis relevant cells, such as macrophages. To characterize the endogenous-S1P effects, our lab generated peculiar mouse models, able to overexpress S1PR1 or S1PR3 selectively in myeloid cells (monocytes/macrophages), basing on Cre-LoxP technology. Likewise, other mouse models may help in studying the role of macrophages in hepatotoxicity and inflammation, by using acetaminophen (APAP) induced liver injury (AILI). Accumulating data suggest innate system may contribute to APAP-induced hepatotoxicity, since inhibition of macrophage activity may significantly block this phenomenon. Our aim was to investigate the macrophage role in cardiovascular and metabolic disease, by using peculiar in vivo models of such diseases, focusing on S1P-pathway and hepatotoxicity. We studied the effect of S1P-signaling amplification in mice overexpressing S1PR1 or S1PR3 in monocytes/macrophages, with regard to atherosclerosis development and inflammation. In addition, we generated and validated AILI mouse model as a core tool for studying the functions of the inflammatory macrophages in liver, in particular to clarify the function of the inflammatory macrophages (recruited) in contrast to the resident Kupffer Cells (KCs). The overexpression of S1PR1/S1PR3 in macrophages was achieved by crossing peculiar flox mice with mice in which Cre-recombinase is expressed under control of lysozyme promoter (Lyz), driving the expression in myeloid lineage. Peritoneal macrophages were isolated from wild type (WT) and S1PR1/3 overexpressing mice (S1PR1/3-Lyz) and cultured under several conditions. All mouse models were characterized at molecular and functional level through qPCR, WB and IF after nucleic acids and proteins extraction from peritoneal cells. Atherosclerosis was evaluated after transplanting bone marrow of S1PR1 overexpressing mice into athero-prone LDLR -/- mice, and atherogenic diet feeding. At sacrifice, blood, internal organs and aortas were collected and analyzed for inflammatory markers and atherosclerotic plaque area was analyzed by Oil-Red-O staining of aortic roots and whole aortas. Concerning AILI mouse model, C57BL/6 TLR4 flox mice were fasted overnight prior to administration of 250 mg/kg APAP by ip injection. Liver and plasma samples were obtained at 24 h at least after AILI to estimate the presence of APAP hepatotoxic damage. S1PR1/S1PR3-Lyz mouse models were fully validated for tissue specific S1PRs overexpression at gene, protein and functional level. We demonstrated the S1PR1-selective stimulation reduced both early and advanced atherosclerotic lesions, concomitantly reducing pro-inflammatory cyto- and chemokines levels in plasma and aorta and the activation of tissue macrophages and T-cells. The AILI mouse model was validated as well performing H&E stained liver sections, ALT measurement, survival rate and flow cytometry analysis. We validated unique mouse models for evaluating macrophage role in cardiovascular and metabolic disease. In particular, we demonstrated for the first time that the amplification of S1P signaling in macrophages dramatically reduces atherosclerotic lesions in vivo and the associated inflammatory burden.
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