Riassunto analitico
Il modello di stimolazione elettrica corneale è stato introdotto come modello animale per lo screening di nuovi farmaci antiepilettici. Recentemente, questo modello è stato proposto per testare terapie alternative nel trattamento dell’epilessia farmacoresistente. Inoltre, questo modello rappresenta l’unico test capace di dimostrare l’effetto anticonvulsivante della dieta chetogenica (DC), un approccio dietoterapico di comprovata efficacia nel controllare le crisi epilettiche. Le caratteristiche principali di questo modello sono: l'induzione di convulsioni minime e standardizzate; l'attivazione di regioni limbiche; la possibilità di sfruttare procedure non invasive che producono alterazioni funzionali. In questo studio abbiamo valutato i possibili cambiamenti nel fenotipo comportamentale epilettico e caratterizzato la risposta delle reti neuronali al test di stimolazione corneale a 6-Hz, nonché la modulazione di tale risposta nel tempo e in seguito alla somministrazione di trattamenti. In particolare, abbiamo modificato il paradigma classico del modello a 6-Hz per simulare le crisi epilettiche ricorrenti, caratterizzando per la prima volta le alterazioni elettroencefalografiche (EEG). Il nostro protocollo ha consistito nell’applicazione di 4 sessioni di stimolazione corneale, con intensità di corrente di 32mA, a distanza di 72 ore l’una dall’altra. La risposta indotta dalle stimolazioni è stata caratterizzata mediante analisi comportamentale, EEG ed immunoistochimica. Inoltre, abbiamo valutato gli effetti anticonvulsivanti della DC, del peptide grelina, ligando per il growth hormone secretagogue receptor 1a (GHS-R1a) e di altri peptidi antagonisti del medesimo recettore, des-acilgrelina (DAG) e EP-80317. Nei primi esperimenti, i topi sono stati sacrificati 24 ore dopo l'ultima stimolazione. L’analisi EEG ha evidenziato che la risposta post-stimolo è caratterizzata da una componente convulsiva e una componente non convulsiva, e che l'attività epilettiforme coinvolge la corteccia occipitale e l’ippocampo solo dopo 4 stimolazioni, suggerendo l’instaurarsi di un processo epilettogeno. La durata del periodo non-convulsivo è progressivamente diminuita dopo la seconda stimolazione, mentre il periodo di tempo convulsivo è rimasto invariato. Inoltre, è interessante notare che dalla seconda di stimolazione si è assistito ad una progressiva ingravescenza delle crisi, le quali, da paucisintomatiche, sono diventate tonico-cloniche generalizzate. Infine, abbiamo osservato un significativo aumento dell’immunoreattività di FosB/ΔFosB in amigdala laterale, dopo la quarta elettrostimolazione. In esperimenti successivi, ai topi è stata somministrata per due settimane la DC con un rapporto 4:1. La dieta si è rivelata essere inizialmente protettiva, riducendo significativamente la durata delle convulsioni psicomotorie nei topi stimolati (-48%); tale effetto è cessato dopo la seconda stimolazione. Infine, i topi sono stati pre-trattati con grelina, DAG e EP-80317, somministrati in singolo o in combinazione con la DC. Una significativa riduzione della durata delle crisi è stata osservata nei topi trattati in acuto con DAG (-27%), mentre il trattamento con grelina è risultato essere inefficace. EP-80317 ha determinato una riduzione (-40%) della durata delle crisi simile a quella osservata nei topi trattati con la dieta. Inoltre, mentre EP-80317 ha ridotto anche la durata della componente convulsiva della crisi, l’effetto protettivo della DC è stato osservato solo sulla durata della componente non convulsiva. I trattamenti acuti con EP-80317 o DAG associati a DC non hanno mostrato alcun ulteriore beneficio. Questi risultati dimostrano rilevanti effetti anticonvulsivanti della DC e, soprattutto, di EP-80317, suggerendo una sua eventuale applicazione terapeutica.
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Abstract
The 6-Hz corneal stimulation model was introduced in early fifties as a model to screen new anticonvulsants. Recently, this model has been rediscovered to test alternative approaches that could be eligible in the treatment of drug resistance seizures. Interestingly, the 6-Hz model has been proposed as a unique model in which to prove the efficacy of the ketogenic diet (KD), which is recognized as an effective treatment to control intractable seizures.
Main features of this seizure model are: (i) induction of a minimal seizure with clear automatized behaviors that are reminiscent of limbic seizures; (ii) induction of intense activation of limbic regions, assessed by immediate early gene expression; (iii) the possibility of non-invasive procedures involving repetitive stimulation, which are aimed at changing the response to seizure induction to produce functional outcomes.
In this study we modified the 6-Hz model to evaluate the possible changes in seizure phenotype and the response to antiepileptic treatments as function of an increasing number of seizures. In particular, we modified the classic 6-Hz paradigm performing four corneal electrostimulations at 32mA repeated on the same animal to simulate recurrent seizures, as observed in epileptic patients. Behavioral, immunohistochemical and electroencephalographic (EEG) methods were used to analyze the possible changes in seizure phenotype and in neuronal network activity by time.
Additionally, we evaluated the anticonvulsant effects of KD, of ghrelin, the endogenous ligand for the growth hormone secretagogue receptor 1a (GHS-R1a) and of other antagonists peptides of the same receptor, des-acilgrelina (DAG) and EP-80317.
In the first experiments, mice were stimulated four times every third day and sacrificed one day after the last stimulation. Seizures were video-EEG recorded and scored. Video-EEG showed that evoked seizures were characterized by a motor and a non-motor component, and that epileptiform activity spread to occipital cortex and hippocampus only after four stimulations, suggesting the occurrence of epileptogenesis. Duration of non-convulsive period progressively decreased after the second session, whereas the convulsive period did not change. Interestingly, a more severe seizure phenotype, consisting of tonic-clonic generalized convulsions, was predominant after the second stimulus session. In addition, we observed a significant increase in FosB/ΔFosB immunoreactivity in the lateral amygdala after the fourth electroshock.
In further experiments, mice were fed for two weeks with the KD (4:1 ratio). The KD treatment was able to protect stimulated mice significantly reducing the duration of psychomotor seizures (-48%), but this effect vanished by repeated seizure induction.
Lastly, mice were pre-treated with ghrelin, DAG and with EP-80317, alone or in combination with KD. A significant reduction in seizure duration was observed in mice when acutely administered DAG (-27%), whereas acute ghrelin treatment was ineffective. EP-80317 caused a reduction (-40%) in seizure duration, which was similar to the reduction observed in KD fed mice. Interestingly, EP-80317 was also able to decrease duration of the convulsive component, whereas the KD only affected the non-convulsive component of seizures. No additional changes in seizure duration and seizure severity were found by combining the KD with acutely administered EP-80317 or DAG.
These findings demonstrate, in a new model of epileptogenesis, relevant anticonvulsant effects of KD and EP-80317. Interestingly, refractoriness to drug treatment developed by repeating the seizure induction, suggesting the induction of proepileptic mechanisms.
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