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Lon è una proteasi mitocondriale, ATP-dipendente, codificata nel nucleo, che interviene nel ripiegamento delle proteine, degrada le proteine ossidate o danneggiate, prevenendo il loro accumulo, e partecipa al mantenimento dei livelli del DNA mitocondriale (mtDNA). Lon è indotta da diversi fattori di stress e la sua attività ed espressione sono modulate in diverse patologie. Lon è up-regolata in diverse cellule tumorali umane, e la riduzione dell'espressione di questa proteina causa profonde alterazioni del proteoma mitocondriale e delle funzioni dell’organello, portando alla fine alla morte cellulare. L'attività enzimatica di Lon è indotta dall'ATP, e inibita dal triterpenoide 2-ciano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oico (CDDO), e dal suo derivato C-28 metil estere (CDDO-Me).
Al fine di chiarire il ruolo della proteasi Lon nelle trasformazione neoplastica, abbiamo analizzato gli effetti della down-regolazione di Lon in un modello cellulare di tumore al colon (cellule tumorali di colon RKO) in cui Lon è stata condizionatamente silenziata mediante RNA interference. Abbiamo studiato l'impatto della down-regolazione di Lon sull'apoptosi cellulare, sui livelli di mtDNA e mtRNA, sulla funzionalità e morfologia mitocondriale. Inoltre, abbiamo valutato gli effetti dell'inibizione farmacologica di Lon, usando CDDO o CDDO-Me. In particolare, abbiamo studiato gli effetti dei triterpenoidi sui mitocondri di tre linee cellulari di tumore (RKO, cellule umane di tumore al colon; HepG2, cellule umane di epatocarcinoma; MCF7, cellule umane di carcinoma mammario). Abbiamo analizzato diversi parametri, quali il potenziale di membrana, la massa, la morfologia, il contenuto ROS e l'attività proteolitica di Lon.
I mitocondri delle cellule in cui Lon è silenziato sono caratterizzate da bassi livelli di trascritti di mtDNA, minori livelli di alcune subunità dei complessi della fosforilazione ossidativa (il complesso I è risultato il più colpito), da una marcata riduzione del tasso di consumo di ossigeno, e dalla ridotta capacità sintetizzare l'ATP. Inoltre, sono stati osservati alti livelli di perossido d’idrogeno e di anione superossido mitocondriale. La rete mitocondriale è apparsa frammentata, con mitocondri eterogenei nella forma e nelle dimensioni, creste dilatate, vacuoli e inclusioni elettrondense. Inoltre, abbiamo osservato che CDDO e CDDO-Me sono potenti fattori di stress per i mitocondri nelle cellule tumorali, poiché inducono livelli più elevati di ROS e alterano la morfologia mitocondriale, mentre tale effetto è risultato molto meno marcato nelle cellule normali non trasformate. In particolare, queste molecole hanno causato una depolarizzazione della membrana mitocondriale e un'alterazione della massa mitocondriale, hanno influenzato i livelli di Lon e quelli di ACO2 e TFAM, due target dell'attività proteolitica di Lon, e hanno indotto apoptosi mediante la via intrinseca. La overespressione di Lon è apparsa in grado di ridurre la morte cellulare per apoptosi nelle cellule trattate con CDDO e CDDO-Me.
In conclusione, Lon può essere considerata una proteina che non induce tumorigenesi di per sé, ma è importante per la sopravvivenza delle cellule tumorali. La sua inibizione farmacologica potrebbe quindi rappresentare una nuova possibile strategia antitumorale.

Lon is a nuclear-encoded, mitochondrial ATP-dependent protease that assists protein folding, degrades oxidized or damaged proteins preventing their accumulation, and participates in maintaining mitochondrial DNA (mtDNA) levels. It is induced by different stressors, and its expression and activity are modulated in different pathologies. Lon is up-regulated in several human cancer cells, and its down-regulation causes profound alterations of mitochondrial proteome and function, and cell death. Lon enzymatic activity is activated by ATP, and inhibited by the triterpenoid 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic acid (CDDO), or by its C-28 methyl ester derivative (CDDO-Me). In order to clarify the role of Lon protease in cancer cells, we analyzed the effects of Lon down-regulation in RKO colon cancer cells, in which Lon could be conditionally silenced by RNA interference. We studied the impact of Lon down-regulation on cellular apoptosis, mtDNA and mtRNAs levels, mitochondrial functionality and mitochondrial morphology. Furthermore, we evaluated the effects of pharmacological inhibition of Lon, using CDDO or CDDO-Me, on mitochondria of three different cancer cell lines (RKO human colon cancer cells, HepG2 hepatocarcinoma cells and MCF7 breast carcinoma cells). We paid a particular attention to parameters such as membrane potential, mass, morphology, dynamics and ROS content, and Lon proteolytic activity. Mitochondria of Lon-silenced cells displayed low levels of mtDNA transcripts, reduced levels of several subunits of oxidative phosphorylation complexes (Complex I being the most affected), a marked reduction of oxygen consumption rate, and impaired capability to synthetize ATP. Higher levels of hydrogen peroxide and mitochondrial superoxide anion could also be observed. Mitochondrial network appeared fragmented, with mitochondria heterogeneous in size and shape, dilated cristae, vacuoles and electrondense inclusions. In addition, we found that CDDO and CDDO-Me were potent stressors for mitochondria in cancer cells, rather than in normal non-transformed cells, being able to induce higher levels of ROS and altered mitochondrial morphology. In particular, these compounds caused depolarization of mitochondrial membrane, altered mitochondrial mass, affected the levels of Lon and those of Aco2 and TFAM, two targets of Lon proteolytic activity, and led to intrinsic apoptosis. The overexpression of Lon could reduce apoptotic of cells treated with CDDO and CDDO-Me. In conclusion, Lon can be considered a protein that does not initiate tumourigenesis per se, but it is important for cancer cell survival. Its pharmacological inhibition could represent a possible new anticancer strategy.