• carcinoma-colonretto
• carcinoma-ovarico
• recettore-folato
• Timidilato-sintasi
• TS-inibitori

La timidilato sintasi (TS) è un enzima essenziale per il suo ruolo centrale nella biosintesi di timidilato e nella riparazione del DNA, dato che la reazione di metilazione catalizzata da TS è la sola fonte de novo di timidilato (Taddia et al., 2015). Questo enzima è il target principale di molti farmaci antitumorali e la sua inibizione si è dimostrata efficace in molte tipologie di tumore, tra cui il carcinoma colon-rettale (CRC) e ovarico (OC). I farmaci inibitori di TS possono legare il sito attivo agendo come il substrato dUMP, tra questi il 5-FU, o possono agire come il cofattore 5,10-metilen-5,6,7,8-tetraidrofolato, come il Raltitrexed e il Pemetrexed (Taddia et al., 2015). Il principale problema di questi farmaci è legato alla loro tossicità e allo sviluppo di resistenza, un fenomeno multifattoriale ma spesso correlato ad una sovra-espressione di TS, causata dalla perdita dell’azione regolatoria con meccanismo di feedback negativo sul proprio mRNA, quando TS lega gli inibitori (translational de-repression). E’ quindi importante identificare nuovi inibitori che agiscano attraverso nuovi meccanismi, senza alterare la funzione regolatoria o incrementare i livelli di TS (Taddia et al., 2015). A questo scopo, sono stati disegnati e sintetizzati peptidi (LR e [DGln4]LR) e piccoli inibitori dissociativi (DI) per legarsi all’interfaccia proteica (inibitori dell’interazione proteina-proteina) di TS.
Questi peptidi hanno mostrato di inibire la crescita cellulare in linee di OC sensibili e resistenti (Cardinale et al., 2011) e anche l’attività enzimatica di TS, senza causarne sovra-espressione (Cardinale et al., 2011; Pelà et al., 2014).
L’attività dei peptidi, somministrati sia con uno specifico sistema di delivery non liposomico, poi con liposomi pH-sensibili PEGilati, è stata studiata anche in combinazione con farmaci chemioterapici con uso clinico, per valutarne una possibile attività sinergica. Successivamente, con l’intento di aumentare la selettività, i peptidi LR e [DGln4]LR sono stati coniugati con l’acido folico (FA) per legare il recettore alfa dei folati (FRα) e sfruttare l’endocitosi mediata dal recettore. Poiché FRα è sovra-espresso in più del 90% dei OC non mucinosi, mentre è quasi assente in cellule normali, abbiamo valutato l’effetto sulla crescita dei bioconiugati su linee cellulari tumorali con differenti livelli di FRα, previa valutazione dell’affinità di legame dei bioconiugati nei confronti del FRα.
Anche l’effetto dei composti DI sulla crescita cellulare e sull’inibizione dei livelli e dell’attività di TS è stato valutato su diverse linee cellulari tumorali di OC e CRC.
Molte delle combinazioni tra farmaci chemioterapici e il peptide [DGln4]LR, somministrato sia coi liposomi che col sistema di delivery, hanno mostrato un effetto additivo in somministrazioni simultanee e sinergico in quelle sequenziali.
I bioconiugati inibiscono la crescita cellulare con un effetto comparabile a quello dei peptidi, con FA-[DGln4]LR lievemente più attivo di FA-LR. Il livello di TS si è visto rimanere stabile, suggerendo un meccanismo d’azione simile a quello dei peptidi, basato sull’interazione a livello dell’interfaccia proteica del dimero.
Alcuni DI hanno mostrato un buon livello di inibizione della crescita cellulare associato ad un aumento dell’apoptosi. L’attività enzimatica risulta diminuire insieme al livello della proteina, probabilmente a causa di una proteolisi mediata dal proteasoma.
I risultati ottenuti da questa ricerca dimostrano che gli inibitori proteina-proteina di TS agiscono tramite un nuovo meccanismo e potrebbero essere efficaci, sia da soli che in combinazione, su linee cellulari di OC e CRC.

Thymidylate synthase (TS) is a highly conserved enzyme, essential for cell survival due to its central role in thymidylate (dTMP) biosynthesis and DNA replication (Taddia et al., 2015). The methylation reaction that TS catalyzes is de novo source of thymidylate. TS has been shown to regulate its protein synthesis by interacting with its own mRNA causing translation repression. This enzyme is a major target for anticancer agents and its inhibition is very effective in different types of cancer including colorectal cancer (CRC) and ovarian cancer (OC). TS-targeting drugs are inhibitors that bind at the active site and that resemble either the substrate dUMP, such as 5-FU, or the cofactor 5,10-methylene-5,6,7,8-tetrahydrofolate (mTHF), as methotrexate or Pemetrexed (Taddia et al., 2015). The main drawback of these therapies is related to drug toxicity and the development of drug resistance, a phenomenon that may be multifactorial but is often associated to TS overexpression and some other folate-dependent proteins caused by the loss of RNA regulatory capacity when it is bound to its inhibitors (translational de-repression) (Taddia et al., 2015). Therefore, it is important to identify TS inhibitors that act through new mechanisms that do not alter RNA regulation or increase protein levels (Taddia et al., 2015). As a strategy to avoid induction of TS expression, some peptides (LR and [DGln4]LR) and small dissociative inhibitors (DI compounds) have been designed and synthesized as dimer interface binding inhibitors (protein-protein interaction inhibitors-PPI) of TS. These peptides proved to inhibit sensitive and resistant OC cell growth (Cardinale et al., 2011) and TS activity without causing its over-expression (Cardinale et al., 2011; Pelà et al., 2014). The peptides activity was studied in combination with chemotherapeutic agents currently in use on OC cell lines, to evaluate a possible synergistic effect. Peptides were administered firstly with a suitable peptide delivery system and then delivered by pegylated pH sensitive liposomes. Secondly, in an attempt to improve the selectivity, LR and [DGln4]LR peptides were conjugated with folic acid (FA), to target the folate receptor (FR), allowing internalization via FR-mediated endocytosis, since the FRα isoform is overexpressed in more than 90% of non-mucinous OCs, while is almost absent in normal cells. Thus, the effect of the bio-conjugates was tested on growth of cancer cell lines expressing different levels of FRα, after evaluation of the relative binding affinity for the FR. DI compounds previously selected were also tested against growth of cancer cell lines and for the inhibition of enzyme protein level and activity. The combinations of most of the drugs with [DGln4]LR showed additive cell killing when concurrently administered and synergistic when sequentially combined to the peptide. The same effects have been obtained with [DGln4]LR-loaded liposomes. The bio-conjugates caused a cell growth inhibition comparable to that of the peptides, with FA-[DGln4]LR slightly more effective than FA-LR. The cellular levels of hTS were found unmodified, suggesting a mechanism of action similar to that of the peptide fragments mainly based on interaction with the protein monomer-monomer interface. Some DI showed a good cell growth inhibition associated with the induction of apoptotic cell death. TS activity was inhibited along with a decrease of TS protein level, probably due to a proteasome-mediated proteolysis. The results obtained in the planned research indicate that these PPI of TS, acting through a novel mechanism, may be effective as drugs alone or in combination against OC and CRC cell lines.