Riassunto analitico
Durante il ciclo di vita di una cellula è necessario che il DNA sia replicato in modo corretto, ovvero che venga mantenuta l’integrità del genoma, dalla quale dipende il destino di una cellula. L’instabilità genomica è una caratteristica che contraddistingue svariati tipi di tumore e ha origine da un accumulo nel tempo di alterazioni nel genoma. Una cellula però ha a disposizione diversi punti di controllo - “checkpoints” - i quali garantiscono la corretta replicazione del DNA durante il ciclo cellulare. In particolare, durante la replicazione, l’attivazione del “checkpoint” mitotico impedisce una precoce entrata in mitosi delle cellule, evitando un’errata segregazione cromosomica e conseguente aneuploidia, una tipica caratteristica di molti tumori. Recentemente, abbiamo caratterizzato una nuova proteina dotata di attività di soppressore tumorale, chiamata Mitostatin, la quale lega due proteine centrosomali, Odf2 e ninein e la cui deplezione causa difetti di ancoraggio dei microtubuli al centrosoma. Dal momento che i difetti funzionali dei centrosomi sono associati ad un processo mitotico aberrante, Mitostatin potrebbe avere un ruolo chiave nel garantire una corretta mitosi nelle cellule. Il nostro studio dimostra che l’assenza di Mitostatin in cellule tumorali, sincronizzate con aphidicolina (blocco in fase G1/S) e rilasciate in terreno contenente nocodazolo, un inibitore del fuso mitotico (attivatore del “checkpoint” mitotico), causa un mancato blocco delle cellule durante l’attivazione del “checkpoint” stesso. In concomitanza, la deplezione di Mitostatin induce una precoce degradazione di due principali regolatori di questo punto di controllo, Mad2 e ciclina B1. L’attivazione del “checkpoint” mitotico ha la funzione fondamentale di garantire che tutto sia in ordine, ritardando l’uscita dalla mitosi; pertanto la precoce degradazione di ciclina B1, osservata in assenza di Mitostatin, porta ad un’evasione delle cellule da questo punto di controllo, uscita anticipata dalla mitosi (“mitotic slippage”) e conseguente instabilità genomica. In particolare, in queste condizioni abbiamo osservato una separazione prematura dei cromatidi fratelli, formazione di ponti tra cromosomi ed una errata segregazione dei cromosomi in anafase. Tutti questi fenomeni sono perfettamente in linea con una difettosa attivazione del “checkpoint” mitotico. Inoltre, in questo studio riportiamo per la prima volta risultati, i quali evidenziano che l’assenza di Mitostatin causa un aumento delle aberrazioni cromosomiche (sia numeriche che strutturali) rispetto a cellule di controllo. Queste aberrazioni includono aneuploidia (P=.0005), cromosomi triradiali (P=.0061) e frammenti cromosomici (P=.0066). In aggiunta, dall’analisi nucleare tridimensionale dei telomeri (3D Q-FISH), effettuata utilizzando TeloView, si evidenzia una diminuzione del numero di telomeri (P=.0061), del numero totale di aggregati telomerici (P=.0027), e anche una diminuzione dell’intensità dei segnali sia singola che totale (P=.018 and P=.019) in cellule deprivate di Mitostatin. Questi risultati suggeriscono che l’assenza di Mitostatin è responsabile di un aumento della disfunzione dei telomeri. La dimuzione dell’intensità telomerica è associata con una continua proliferazione “mitotic slippage”, e allo stesso tempo gli aggregati dei telomeri indica una instabilità genomica in corso. Nel loro insieme, tutte queste osservazioni suggeriscono che Mitostatin assume un ruolo importante nel custodire la fedeltà mitotica, consentendo la corretta attivazione del “checkpoint” mitotico. Pertanto, bassi livelli di Mitostatin, trovati in diversi tumori, potrebbero contribuire alla trasformazione cellulare favorendo l’instabilità genomica.
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Abstract
Genomic instability is a characteristic of most cancers and it refers to an increased tendency of alterations in the genome during the life cycle of cells. The fidelity of DNA replication is highly ensured by different checkpoints; the activation of spindle checkpoints prevents cells from premature entry into mitosis, avoiding incorrect chromosome segregation and aneuploidy, a typical feature of many cancers. Mitostatin, a novel protein, endowed with tumor suppressor activity, has been reported to bind centrosomal proteins Odf2 and ninein, and its depletion causes an alteration of the anchorage of microtubules to the centrosome. Since functional defects of centrosomes are associated to mitotic failure, Mitostatin may have a key role in guarding the fidelity of mitosis in cells.
Here we show that the depletion of Mitostatin in cancer cells, synchronized by aphidicolin (G1/S) block and released into nocodazole-containing medium, leads to mitotic slippage and adaptation to the spindle checkpoint in the presence of a spindle inhibitor. Concomitantly, Mitostatin depletion promotes the early degradation of Mad2 and cyclin B1. Since the activated spindle checkpoint delays cell exit from mitosis by preventing cyclin B1 proteolysis, the cyclin B1 early degradation leads to mitotic checkpoint escape and resulting chromosome instability. In particular, we observed a premature sister-chromatid separation, chromosome bridges and mis-segregation in anaphase that are consistent with defective activation of the spindle checkpoint.
In this study, we report for the first time that the depletion of Mitostatin induces an increase of numerical and structural chromosomal aberrations compared to control cells. These aberrations include aneuploidy (P=.0005), the formation of triradials (P=.0061) and broken chromosomes (P=.0066). Moreover, 3D nuclear telomere analysis using TeloView shows decreases in telomeric signals (P=.0061), in the total number of aggregates (P=.0027), and in total intensity (P=.018) and single intensity (P=.019) in cells depleted of Mitostatin. These findings suggest that telomere dysfunction is increased in the absence of Mitostatin; the decrease in telomere intensity is associated with ongoing proliferation (mitotic slippage), and the maintenance of telomeric aggregates is indicative of ongoing genomic instability.
Taken together, these observations suggest that Mitostatin plays a critical role in guarding the fidelity of mitosis, enabling the optimal activation of the spindle checkpoint. Thus, low levels of Mitostatin found in certain human tumors may contribute to cellular transformation by promoting genomic instability.
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