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L’influenza del DNA mitocondriale (mtDNA) è un carattere scarsamente considerato per la selezione di lieviti per utilizzo industriale e per i programmi di miglioramento genetico. Tuttavia, l’importanza delle funzionalità respiratorie non è da sottovalutare.
Abbiamo condotto un programma di miglioramento di ceppi di lievito utilizzati per la vinificazione in campo industriale, incrociando la specie più comune, Saccharomyces cerevisiae, con il suo parente più lontano, Saccharomyces uvarum, incluso nel complesso Saccharomyces sensu stricto. Volendo considerare un ampio background genetico, abbiamo effettuato lo screening su 58 ceppi di S. uvarum. I nostri risultati hanno evidenziato un’ampia diversità genetica e fenotipica fra i ceppi, individuando quelli in grado di competere con S. cerevisiae e idonei quindi alla fermentazione del vino.
L’ereditarietà del mtDNA in ibridi interspecifici è oggetto di una controversa discussione, tuttavia molti studi non si basano su un numero elevato di ibridi. Come strategia di incrocio per il miglioramento dei lieviti da vino abbiamo applicato il ‘spore-to-spore mating’. Con questo metodo è possibile ottenere ibridi isogenici contenenti diversi tipi di mtDNA. Gli ibridi sono stati validati usando un metodo veloce basato sulla “colony PCR” delle regioni ITS1 o ITS2 rDNA e sulla successiva analisi RFLP. Questa tecnica permette di ridurre i tempi necessari per verificare il successo degli eventi di mating. Per incrementare il numero di ceppi S. cerevisiae x S. uvarum è stato applicato il metodo del ‘staggered mating’ che consiste nell’indurre la sporificazione dei gameti di S. uvarum due ore prima di quelli del ceppo di S. cerevisiae.
Il ‘mitotyping’ è stato condotto su tre geni mitocondriali per rivelare eventuali ricombinazioni. I nostri risultati dimostrano che l’ereditarietà del mtDNA non è casuale, ma è dominata da uno dei due ceppi parentali. Incroci con lo stesso parentale di S. cerevisiae comportavano lo stesso tipo di mtDNA anche se cambiava il ceppo di S. uvarum. Solo un ibrido ha evidenziato un profilo di mtDNA eteroplasmico. In alcuni casi, gli incroci comportavano la formazione di “petit mutant” incapaci di effettuare la respirazione. Infine per una sola linea di breeding sono stati ottenuto ibridi con mtDNA in alcuni casi di S. cerevisiae, in altri di S. uvarum oppure dei ‘petite mutant’.
Usando questi ibridi come sistema modello abbiamo studiato l’effetto del mtDNA sui parametri tecnologici relativi alla crescita, alla capacità di respirare o di effettuare la fermentazione alcolica. Gli ibridi che possedevano il tipo mitocondriale di S. cerevisiae sono risultati quelli in grado di sviluppare meglio e più velocemente rispetto ai loro ceppi parentali. Gli ibridi con mtDNA di S. uvarum mostravano una crescita simile al parentale di S. cerevisiae e superiore a quella del parentale di S. uvarum. Il coefficiente respiratorio fra O2 consumato e CO2 prodotta è risultato più alto negli ibridi con mtDNA di S. uvarum. Il ceppo ibrido con mtDNA di S. uvarum tendeva a respirare, consumando più O2 del ceppo isogenico che possiedeva il mtDNA di S. cerevisiae.
Per quanto riguarda la velocità di fermentazione non è stato possibile rilevare effetti significativi del mtDNA, tuttavia, la percentuale di etanolo prodotta è risultata variare in funzione del tipo mitocondriale e della temperatura. Infatti, a una temperatura di fermentazione di 12 °C il contenuto di etanolo prodotto risultava più alto per gli ibridi con mtDNA di S. cerevisiae, mentre a una temperatura di 28 °C erano quelli con il mtDNA di S. uvarum a produrre percentuali più alti di etanolo. Questi risultati evidenziano un’influenza del mtDNA sugli aspetti tecnologici e pertanto dovrebbero essere considerati nei programmi di miglioramento.

The effect of mitochondrial DNA (mtDNA) was often neglected for industrial yeasts. In strain improvement programmes this is a not considered factor, but the importance of the functionality of respiration is not to be underestimated. We drove a strain improvement programme for industrial wine yeasts, crossing the most common wine yeast Saccharomyces cerevisiae with its furthest relative within the Saccharomyces sensu stricto complex, Saccharomyces uvarum. As a large genetic background is required for an improvement programme, we screened 58 strains belonging to the S. uvarum species. Our results reveal a large genetic and phenotypic diversity among the tested strains and manifest strains being suitable for wine fermentation, competitive with S. cerevisiae strains. The inheritance of mtDNA in interspecific hybrids is discussed controversially, while most studies did not consider high numbers of hybrids. As breeding strategy for the improvement of wine yeast we chose spore-to-spore mating. As it is possible with this method to obtain isogenic hybrids, we were interested in obtaining isogenic hybrids possessing different types of mtDNA. Hybrids were detected by a fast-method based on a colony PCR targeting the ITS1 or ITS2 rDNA region with a subsequent RFLP analysis. Using this method time consuming DNA extractions, to exclude unsuccessful mating events, could be avoided. Furthermore, we can conclude that the number of S. cerevisiae x S. uvarum interspecific hybrids increases, applying staggered mating. In these trials the S. uvarum gamete was induced to germinate two hours before the S. cerevisiae strain. Mitotyping of the resulting hybrids was carried out on three mitochondrial genes to detect eventual recombination events. Our results show that the inheritance of mtDNA is not random and it is dominated by one parental strain. Breeding lines with the same S. cerevisiae parental strain obtained the same mitotype, although the parental S. uvarum strain changed. Only one hybrid strain displayed heteroplasmic mtDNA pattern. Some crosses were unable to restore respiration capacity, resulting in ‘petite mutants’. For one breeding line we obtained hybrids with different mitotypes, such as S. cerevisiae, S. uvarum and ‘petite mutant’. Using these hybrids as model systems, we studied the effect of the mitochondria on technological aspects, such as growth capacity, respiration capacity and alcoholic fermentation. The hybrids owning the S. cerevisiae mtDNA showed the best growth capacity. These hybrids grew faster than both of their parental strains. Hybrids with the mtDNA of S. uvarum showed a growth capacity like the S. cerevisiae parental strain and superior to the S. uvarum parental strain. Respiration coefficient between consumed O2 and produced CO2 is higher for the S. uvarum mitotype than the S. cerevisiae mitotype under the tested conditions. This strain tends to respire, consuming more O2 than its sibling strain owning the S. cerevisiae mitotype. No significant effect on the fermentation speed could be proven, but the yield of produced ethanol varies depending on mitotype and temperature. At a fermentation temperature of 12 °C the yield of produced ethanol was higher for the S. cerevisiae mitotype, while at 28 °C the S. uvarum mitotype yielded higher amounts of ethanol. These results show the technological aspects of diverse mitotypes, which should be considered in breeding programmes.