Riassunto analitico
Senza dubbio decenni di ricerche hanno contribuito al miglioramento degli esiti di pazienti malati di cancro, ma due problematiche restano ancora evidenti: la creazione di terapie più efficaci e specifiche e l’identificazione di nuovi biomarkers utili per ottimizzare diagnosi e prognosi. Queste richieste sono diventate più urgenti che mai a causa dell’eterogeneità e complessità dei tumori. A questo proposito, gli esosomi, vescicole racchiuse da membrana che vengono rilasciate dalle cellule nello spazio interstiziale, stanno emergendo come potenziali riserve di biomarkers per la diagnosi e per la progressione tumorale. Dal momento che molte proteine sono differentemente espresse in alcuni stadi e tipi di tumore mammario e, data la mancanza di markers e targets specifici, dalla caratterizzazione di queste vescicole potrebbero derivare grandi benefici. In particolare, il nostro interesse si è focalizzato sulla progressione del tumore e sui suoi caratteri di aggressività e invasività attraverso lo studio dell’espressione proteica differenziale di esosomi derivati da linee cellulari di carcinoma mammario con diverso grado di malignità. A questo scopo, abbiamo selezionato una linea cellulare di carcinoma mammario altamente invasiva MDA-MB-231 e, come controllo, abbiamo utilizzato la stessa linea cellulare geneticamente modificata per perdere i suoi caratteri di invasività, Slug-shRNA MDA-MB-231. E’ stato messo a punto un metodo di centrifugazione differenziale per la purificazione di esosomi e, per testarne l’efficacia e quantificare il numero e la dimensione degli esosomi purificati, i pellets sono stati osservati al microscopio elettronico a trasmissione. Successivamente è stata eseguita l’analisi proteomica mediante elettroforesi bidimensionale, seguita da analisi con software PD-quest per l’identificazione di spots proteici differentemente espressi e statisticamente significativi. 18 Spots sono stati processati e analizzati mediante spettrometria di massa. 9 Proteine su 18 sono risultate up-regolate negli esosomi della linea cellulare più aggressiva, mentre 9 sono risultate down-regolate. Le proteine identificate possono essere presentate con dei raggruppamenti fatti sulla base delle loro funzioni: proteine di segnalazione (β2-microglobulin, guanine nucleotide binding protein, hedgehog-interacting protein, peptidyl-prolyl cis-trans isomerase, cartilage intermediate layer protein 1, GA-binding protein), proteine coinvolte nella risposta cellulare allo stress (NDRG1, Annexin A2, PEDF), proteine coinvolte nel metabolismo cellulare (triosephosphate isomerase, phosphoglycerate mutase 1, apolipoprotein A1, phosphatidylinositol 5-phosphate 4-kinase 2α, NAMPT, melanoma associated antigen E2), proteine che regolano il ciclo cellulare (CLIC1) o il processo di coagulazione (Annexin 5). Tutte queste proteine correlano con l’aggressività del tumore. Per confermare la presenza esclusiva di queste proteine all’interno degli esosomi, anche le proteine differentemente espresse nei lisati cellulari delle due linee testate sono state analizzate mediante spettrometria di massa: i pattern proteici delle cellule sono risultati differenti da quelli degli esosomi e la linea cellulare altamente invasiva non ha mostrato over-espressione di quelle proteine trovate up-regolate nei corrispondenti esosomi. E’ ragionevole pensare che le vescicole contribuiscano in qualche modo agli eventi di iniziazione, progressione e infiltrazione tumorale. Potrebbero ad esempio trasmettere quei messaggi necessari per aumentare la malignità di cellule neoplastiche o addirittura condurre alla trasformazione di cellule non cancerose. Pertanto, la ricerca di biomarkers per carcinoma mammario o altre forme tumorali potrebbe ottenere risposte promettenti dall’attenta caratterizzazione del contenuto degli esosomi.
|
Abstract
There is no doubt that decades of challenging investigation have contributed to improve cancer patients outcomes, but two critical problems still remain: the design of more effective and specific therapies and the identification of new biomarkers for better diagnosis and prognosis. These topics have become more significant than ever because of cancers heterogeneity and complexity. In this regard, exosomes, membrane-enclosed vesicles released by cells into interstitial space, are emerging as potential reservoirs of biomarkers for cancer detection and progression. Since several proteins have been found differentially expressed in certain stages and types of breast cancer, and given the lack of specific markers and tumor-targets, great benefits could be gained by vesicles characterization. In particular our interest has been focused on cancer progression and aggressiveness through the study of the differential protein expression in exosomes derived from breast cancer cell lines with different malignancy.
For this purpose, we selected the highly invasive MDA-MB-231 cell line and, as a control, the same cell line genetically modified, in order to lose invasiveness (Slug-shRNA MDA-MB-231). An isolation method was setup in order to purify exosomes through differential centrifugation. To test the efficacy of the isolation method and quantify the number of vesicles and their diameters, collected exosomes were observed under a transmission electron microscopy. A proteomic analysis by two-dimensional electrophoresis was performed, followed by PD-quest analysis for identification of statistically significant and differentially expressed protein spots. 18 Spots have been processed and analyzed by mass spectrometry for protein identification. 9 Proteins out of 18 were found up-regulated in the exosomes derived from the aggressive cell line MDA-MB-231, while 9 were found down-regulated. The identified proteins can be grouped on the basis of their function: signal proteins (β2-microglobulin, guanine nucleotide binding protein, hedgehog-interacting protein, peptidyl-prolyl cis-trans isomerase, cartilage intermediate layer protein 1, GA-binding protein), proteins involved in cellular stress response (NDRG1, Annexin A2, PEDF), protein involved in cellular metabolism (triosephosphate isomerase, phosphoglycerate mutase 1, apolipoprotein A1, phosphatidylinositol 5-phosphate 4-kinase 2α, NAMPT, melanoma associated antigen E2), proteins regulating the cell cycle (CLIC1) or the process of coagulation (Annexin 5). It is clear that all of these proteins are linked with the aggressiveness of tumor.
In order to confirm the exclusive presence of these proteins within the exosomes, also the proteins differentially expressed in the whole cell lysates of the two tested cell lines have been analyzed by mass spectrometry: the proteins pattern in cells was different from that of exosomes, and highly invasive MDA-MB-231 cell line did not show any over-expression of the proteins founded up-regulated in the corresponding exosomes.
It is reasonable to assume that vesicles contribute somehow in the events related to initiation, progression and infiltration of tumors. They could convey signals enhancing the malignancy of neoplastic cells or even leading to the transformation of non-cancerous cells. Thus, biomarker research in breast cancer or other types of cancers can gain a great feedback from a careful exosomes content characterization.
|