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Candida albicans è uno dei patogeni più coinvolti nelle infezioni associate ai biofilm che si formano su impianti medicali quali cateteri, valvole artificiali, protesi. L’impatto clinico di tali infezioni è molto pesante: i microrganismi cresciuti in forma di biofilm mostrano una diminuita sensibilità ai chemioterapici e le infezioni associate sono difficili da eradicare. Il biofilm di Candida diventa infatti una sorgente di candidemie invasive associate ad un’alta mortalità (30-40%). Finora pochi studi hanno indagato le interazioni tra virus patogeni umani e biofilm, focalizzandosi sui biofilm in ambiente acquatico. Non risulta invece indagata l’interrelazione tra biofilm nell’ospite umano e virus.
In questo studio abbiamo valutato: i) se l’Herpes Simplex Virus tipo 1 (HSV-1) e Coxsackievirus B5 (CVB5) possono essere trattenuti nel biofilm di Candida albicans, mantenendo la loro infettività, e poi rilasciati; ii) se il biofilm di Candida può intrappolare cellule non aderenti infettate da HSV-1; iii) se differenti materiali per cateteri (silicone e PVC) si comportano in maniera diversa per quel che concerne le interazioni tra virus e biofilm; iv) la localizzazione, all’interno del biofilm, dei virus e delle cellule inglobate; v) la sensibilità a farmaci antivirali di cellule infettate da virus e inglobate nel biofilm.
I biofilm di Candida albicans venivano cresciuti in micropiastre da coltura cellulare e poi esposti a inoculi acellulari di HSV-1 e CVB5 per 48h: dopo un abbondante lavaggio e raschiamento dei pozzetti per staccare e recuperare il biofilm, la carica virale in questo materiale veniva titolato con il metodo della diluizione limite. In parallelo, venivano allestiti anche pozzetti con un ceppo di Candida albicans non produttore di biofilm (planctonica) e controlli negativi con solo mezo di coltura processati allo stesso modo. Inoltre, i biofilm di Candida sono stati esposti anche a cellule linfoblastoidi non aderenti infettate con HSV-1 e, dopo lavaggio e raschiamento, sono stati determinati il numero di cellule vitali attaccate al biofilm e il titolo virale. Successivamente a queste prove effettuate su plastica, il biofilm è stato fatto crescere su cateteri di silicone e di PVC e anche su dischi di silicone: in questo caso sono stati determinati la massa e l’attività metabolica del biofilm mediante colorazione con Cristal Violetto e saggio XTT e l’abilità di inglobare particelle di HSV-1 e cellule infettate con HSV-1. Per la localizzazione degli antigeni virali edelle cellule infettate all’interno del biofilm è stata utilizzata una doppia colorazione in fluorescenza con un anticorpo monoclonale contro HSV-1 e UVitexB. E’ stata valutata la sensibilità ad acyclovir e foscarnet in cellule infettate da HSV-1 inglobate o no nel biofilm aggiungendo dosi scalari dei due farmaci alle colture determinando la Dose Inibente 50 (DI50).

Particelle virali di HSV-1 e di CVB5 e anche linfociti infettati con HSV-1vengono trattenuti nel biofilm, mantenendo la loro infettività, con titoli significativamente più elevati che in presenza di Candida planctonica o nei controlli negativi. Questo fenomeno si verifica indipendentemente dal tipo di superficie (plastica delle piastre da coltura, silicone, PCV). Le prove di sensibilità ai farmaci antiherpetici hanno evidenziato un aumento di molte volte della DI50 nelle cellule inglobate nel biofilm. Il materiale virale è stato osservato disperso irregolarmente all’interno del biofilm. Questi risultati mostrano per la prima volta che il biofilm di Candida può intrappolare virus e cellule infettate da virus che mantengono la loro infettività e vengono poi successivamente rilasciati. Questi riscontri suggeriscono l’ipotesi che il biofilm che cresce su impianti biomedicali possa costituire un ulteriore rischio anche di infezioni virali meno responsive ai farmaci antivirali nei pazienti con impianti biomedicali

Candida albicans is known as one of the major cause of infections related to biofilms on medical devices such as catheters, artificial valves, prostheses. The clinical impact of such infections is very heavy: the microrganisms grown as biofilms become resistant to chemotherapy and the related infections are difficult to eradicate. Candida biofilm is a source of invasive candidemia with high mortality rates (30-50%). So far, only few studies investigated the interactions between human pathogenic viruses and biofilms, mainly focusing on water biofilms. To our knowledge, there are no studies on the interplay between biofilms in humans and viruses. In this study, we evaluated: i) whether Herpes Simplex Virus type 1 (HSV-1) and Coxsackievirus type B5 (CVB5) can be encompassed in Candida albicans biofilm, retaining their infectivity, and then be released; ii) whether Candida biofilm has the ability to hold non adhering HSV1-infected cells; iii) whether different materials for catheters (silicone and PVC) have a different behaviour as far as virus interactions with biofilm; iv) the localization, inside the biofilm, of entrapped viruses and cells; v) antiviral drug sensitivity of virus infected cells inside the biofilm.. Candida albicans biofilms were grown in tissue culture microplates and then exposed to cell free inocula of HSV-1 or CVB5 for 48h: after deep washing and energetic scapring of the wells to detach and rescue the biofilm, the viral load in this material was end-point titrated on VERO cells. In parallel, wells with a strain of non-biofilm producer Candida albicans (planktonic) and negative controls with only medium were processed at the same way. Moreover, Candida biofilms were exposed to non adhering lymphoblastoid HSV1-infected cells and then, after washing and scraping, the number of living cells attached to the biofilms and virus titer were determined. In addition, Candida biofilm were also grown on silicone and PVC medical catheters as well on silicone disks: on these samples biofilm mass and metabolic activity were measured by Crystal Violet staining and XTT assay and then the ability to encompass free HSV-1 particles and HSV1-infected cells was ascertained. Virus antigens and infected cells were localized inside the biofilm by immunofluorescence staining with anti HSV-1 monoclonal antibody and UVitex2 and by electron microscopy. In biofilms with embedded HSV1-infected cells sensitivity to antivirals drug (acyclovir and foscarnet) was asceretained by adding scalar doses of the two drugs to HSV1-infected cells embedded or not in Candida biofilm, determining the Inhibiting Dose 5 (ID50). Free virus particles of HSV-1 and CoxB5 as well as HSV1-infected cells remained embedded in the biofilm, retaining their infectivity, with a significantly higher load than in the presence of planktonic Candida or in the negative controls. This phenomenon was observed regardless of the surface type (plastic microplate, silicon, PVC) used. Viral material was observed dispersed inside the biofilm. HSV-1 infected cells embedded in biofilm displayed a reduced sensitivity to antiherpetic drugs, with significantly higher ID50. These results provide the first evidence that infectious viruses, after being entrapped in Candida biofilms, can retain their infectivity and be released. Biofilm might therefore be a source also of viral infections displaying reduced sensitivity to antivirals so posing a health risk for patients with implanted medical devices