Riassunto analitico
Le Lytic Polysaccharide Monooxygenases (LPMOs) sono una classe di metallo-enzimi, di origine fungine fungina, ma anche batterica, virale e animale (artropodi). Tali enzimi operano in sinergia con altri enzimi idrolitici, i quali agendoiscono su sostanze recalcitranti come, ad esempio, cellulosa e chitina. Le LPMO presentano la possibilità di essere utilizzatipossono essere utilizzate in processi industriali di bioraffineria, potendo essere inclusi in mix enzimatici utili alla degradazione di biomasse lignocellulosiche ottenute come scarti dall'industria agroalimentare. Il meccanismo d’azione di questi enzimi è tuttora ambiguo e per questo motivo sono necessari molti studi che ne approfondiscano il funzionamento. Da recenti studi si è scoperto che le LPMO sono enzimi rame-dipendenti, in grado di catalizzare l’ossidazione per la rottura di legami glicosidici in presenza di un donatore di elettroni (enzimatico o non enzimatico) e di perossido di idrogeno. Lo scopo del lavoro è stato quello di produrre, purificare e caratterizzare tre differenti LPMO fungine, una originaria dida Fomitopsis pinicola e due da i Phanerochaete chrysosporium: FpAA14A, PcGH61D e PcCel61D (della classe AA9). La produzione è stata svolta attraverso l’espressione eterologa, sfruttando il lievito Pichia pastoris in tre differenti fermentazioni con lo scopo di ottenere considerevoli volumi. A seguito di ogni fermentazione è stato eseguito uno o più step di purificazione tramite cromatografia a interazione idrofobica (HIC) e talvolta, tramite cromatografia a scambio anionico (AEX). Al termine di ogni step di purificazione sono stati svolti saggi enzimatici rapidi e consolidati per osservarne la crescente attività su differenti substrati, come 2,6-dimetilfenolo e/o hydrocoerulignone. La seconda parte del lavoro, invece, si è focalizzata sull’attività di legame a substrati quali cellulosa microcristallina e phosphoric acid swollen cellulose (PASC). Quest’ultimo esperimento è stato svolto in presenza di PcGH61D e in seguito di NcLPMO9C (LPMO da Neurospora crassa), ben caratterizzata in lavori precedenti. Lo scopo di questo esperimento è stato quello di osservare il modo in cui legassero le LPMO ai substrati cellulosici con differenti gradi di cristallinità. Originariamente, al posto di NcLPMO9C doveva essere testata la LPMO PcCel61D da P. chrysosporium, ma dopo il primo step di purificazione non era stata trovata alcuna attività enzimatica. Inoltre, come PcCel61D, l’enzima NcLPMO9C presenta un carbohydrate-binding module (CBM), ovvero un dominio proteico che permette di legare più saldamente un enzima al substrato.
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Abstract
Lytic Polysaccharide Monooxygenases (LPMOs) are a metal-enzymes found in fungi, bacteria, viruses and animals (arthropods). These enzymes act in synergy with other hydrolytic enzymes, which are able to degrade recalcitrant substrates such as cellulose, hemicellulose and lignin. LPMOs could be utilized in industrial biorefinery process, because they could be included in enzymatic mixtures useful for degrading lignocellulosic biomasses, obtained from agro-alimentary industry. Their mechanism of action is still not clear and, due to this reason, many aspects need to be investigated. Recent works showed that LPMOs are Cu-dependent enzymes, which can catalyze the oxidative cleavage of a glycosidic bond in the presence of hydrogen peroxide and an electron donor (it can be enzymatic or not). The aim of this work was the production, the purification and the characterization of three different fungal LPMOs, one originating in Fomitopsis pinicola and two ina Phanerochaete chrysosporium: FpAA14A, PcGH61D e PcCel61D (AA9 class). Production of LPMOs was achieved through a heterologous expression with Pichia pastoris as expression host, in three different fermentation in order to obtain significant amount of volumes. Afterwards, it has been performed one or two purification steps through hydrophobic interaction chromatography (HIC) and/or anion exchange chromatography (AEX). At the end of every purification step, fast enzymatic assays were accomplished in order to find activity using different substrates, such as 2,6-dimethoxyphenol and hydrocoerulignone. During the second part of this work, the binding activity of LPMOs on different cellulosic substrates has been observed. Microcrystalline cellulose and phosphoric acid swollen cellulose (PASC) were utilized as substrates. The binding activity was observed for the LPMOs PcGH61D and NcLPMO9C (LPMOs of Neurospora crassa), which was already well characterized in previous works. The aim of this second experiment was showing the different ways of binding of LPMOs to two different cellulosic substrates, with different degrees of crystallinity. However, this experiment was originally arranged for PcGH61D and PcCel61D, because they are expressed from the same organism P. chrysosporium, instead of NcLPMO9C. Nevertheless, after the first step of purification the enzymatic activity of PcCel61D was not detected. Moreover, the LPMO NcLPMO9C has a carbohydrate-binding module (CBM), a protein domain that is involved in helping the enzyme for binding a substrate.
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