Riassunto analitico
Un metodo “heart-cut” - cromatografia liquida bidimensionale achirale-chirale con spettrometria di massa triplo quadrupolo (LC-LC-MS / MS) è stato sviluppato ed accoppiato con microdialisi intracerebrale in vivo per valutare la risposta cerebrale al composto chirale (±)-7-cloro-5-(3-furanil)-3-metil-3,4-diidro-2H-1,2,4-benzotiadiazina-1,1-diossido ((±)-1), un potente modulatore allosterico positivo (PAM) del recettore AMPA. Il metodo è stato utilizzato con successo anche per valutare il suo metabolismo stereoselettivo e la sua attività biologica in vitro. In particolare, il metodo achirale LC sviluppato, impiega una colonna a base di silice pentafluorurata (Discovery HS-F5) per separare dopamina, acetilcolina, serotonina, (±)-1 e due suoi metaboliti derivanti da idrolisi chimica e ossidazione enzimatica. Nella configurazione "heart-cut" bidimensionale achirale-chirale, (±)-1 e (±)-1d4 eluiti dalla colonna achirale (1° dimensione), sono stati trasferiti in una colonna chirale con fase stazionaria a base di policasccaridi (2° dimensione , Chiralcel OD-RH) utilizzando una valvola automatica a sei vie. I singoli enantiomeri di (±)-1 sono stati separati e rilevati utilizzando la modalità di ionizzazione elettrospray positiva e quantificati in modalità di selected reaction monitoring (SRM). Il metodo è stato convalidato e ha mostrato buone prestazioni in termini di linearità, accuratezza e precisione. Il nuovo metodo impiegato ha mostrato le sue diverse possibili applicazioni nella valutazione di: (a) risposta cerebrale a composti neuroattivi misurando variazioni nel cervello dei livelli extracellulari di neurotrasmettitori selezionati ed altri biomarker; (b) penetrazione della barriera emato-encefalica di farmaci candidati misurando la concentrazione libera del farmaco in specifiche aree cerebrali; (c) presenza di metaboliti del composto testato nel liquido extracellulare del cervello che potrebbero rivelarsi molto utili durante la scoperta di nuovi farmaci; (d) una possibile metabolizzazione stereoselettiva o attraversamento stereoselettivo della barrieria emato-encefalica dei farmaci chirali.
Inoltre, rispetto ai metodi riportati in letteratura, questa tecnica evita la necessità di sacrificare un animale ad ogni tempo di misurazione della concentrazione del farmaco in tutto il tessuto cerebrale; infine, tale metodo permette il monitoraggio continuo delle concentrazioni extracellulari sia dei singoli enantiomeri di un farmaco chirale che dei suoi metaboliti in particolari regioni cerebrali per ogni punto temporale selezionato e per il periodo desiderato utilizzando un singolo animale.
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Abstract
A “heart-cut” two-dimensional achiral-chiral liquid chromatography combined with triple-quadrupole mass spectrometry method (LC–LC–MS/MS) was developed and coupled to in vivo cerebral microdialysis to evaluate the brain response to the chiral compound (±)-7-chloro-5-(3-furanyl)-3-methyl-3,4-dihydro-2H-1,2,4-benzothiadiazine-1,1-dioxide ((±)-1), a potent positive allosteric modulator (PAM) of AMPA receptor. The method was successfully employed to evaluate also its stereoselective metabolism and its in vitro biological activity. In particular, the LC achiral method developed employs a pentafluorinated silica based column (Discovery HS-F5) to separate dopamine, acetylcholine, serotonin, (±)-1 and its two metabolites derived from chemical hydrolysis and enzymatic oxidation. In the “heart-cut” two-dimension achiral-chiral configuration, (±)-1 and (±)-1-d4 eluted from the achiral column (1st dimension), were transferred to a polysaccharide-based chiral column (2nd dimension, Chiralcel OD-RH) by using an automatic six-port valve. Single enantiomers of (±)-1 were separated and detected using electrospray positive ionization mode and quantified in selected reaction monitoring (SRM) mode. The method was validated and showed good performance in terms of linearity, accuracy and precision. The new method employed showed several possible applications in the evaluation of: (a) brain response to neuroactive compounds by measuring variations in the brain extracellular levels of selected neurotransmitters and other biomarkers; (b) blood brain barrier penetration of drug candidates by measuring the concentration of free drug in selected brain areas; (c) the presence of drug metabolites in the brain extracellular fluid that could prove to be very useful during drug discovery; (d) a possible stereoselective metabolization or blood brain barrier stereoselective crossing of chiral drugs.
Moreover, compared to other methods reported in the literature, this technique avoids the necessity of euthanizing an animal at each time point to measure drug concentration in whole brain tissue. Lastly, this method provides continuous monitoring of extracellular concentrations of both the single enantiomers of a chiral drug and its metabolites in specific brain regions at each selected time point for a desired period by using a single animal.
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