Riassunto analitico
Il tratto gastrointestinale umano è un ambiente complesso e popolato da centinaia di specie batteriche (circa 1012cellule/g di feci), archea ed eucarioti. Questo progetto riguarda l’applicazione delle tecnologie di Next Generation Sequencing per due ambiti di ricerca volti ad una caratterizzazione più approfondita del microbiota intestinale umano: da un lato lo studio dei funghi intestinali, dall’altro l’identificazione di gruppi batterici capaci di usare proteine e amminoacidi come fonti di carbonio. La popolazione eucariotica rappresenta una componente importante nell’ecosistema intestinale, in grado di svolgere ruoli sia positivi che negativi per la salute, ma rimane relativamente poco caratterizzata. L’impiego di metodi coltura dipendenti ha dimostrato che la concentrazione di funghi isolati dalle feci di individui sani risulta essere inferiore a 105 cellule/g suggerendo che questi rappresentano una piccola parte del microbiota intestinale, ma risulta ancora da chiarire se si tratta di una colonizzazione permanente o transiente. Questa parte del progetto ha avuto come scopo lo studio della popolazione fungina intestinale in 8 adulti sani confrontando campioni fecali nell’arco di un anno (tempo 0, dopo 3 mesi e dopo 12 mesi). La composizione di tale popolazione, in termini di concentrazione e attribuzione tassonomica, è stata analizzata attraverso l’impiego di tecniche sia coltura dipendenti che indipendenti. L’analisi metagenomica, eseguita con successo su 14 campioni ha permesso di identificare 155 OTUs corrispondenti a differenti specie e generi fungini. La maggior parte dei funghi è stata caratterizzata a livello di genere. Confrontando la caratterizzazione tassonomica svolta sugli isolati da coltura con quella metagenomica, quest’ultima ha identificato nuovi generi facilmente riferibili alla frazione fungina non coltivabile. La seconda parte dello studio ha riguardato la caratterizzazione della popolazione batterica intestinale in grado di sviluppare su terreno contenente proteine come fonte di carbonio. Il metabolismo delle proteine ad opera della popolazione batterica commensale intestinale ha numerosi effetti sulla salute dell’ospite in quanto porta alla produzione di composti potenzialmente tossici (es. indolo, cresolo, ammonio). Al fine di identificare i gruppi batterici coinvolti nel catabolismo intestinale delle proteine, colture di microbiota intestinale umano sono state condotte in modelli in vitro impiegando un terreno di crescita in cui proteine e peptoni rappresentavano la sola fonte di carbonio. Le colture sono state incubate a 37 °C (pH 6.8) in stretta anaerobiosi. La composizione del microbiota è stata studiata al tempo iniziale e dopo 6 ore di processo tramite sequenziamento Illumina. Le prime 6 ore di processo sono quelle in cui ci si aspetta il maggiore utilizzo di proteine e peptoni come fonte di carbonio. Successivamente, cambiamenti nella composizione del comunità batterica sono riferibili alla proliferazione di batteri che utilizzano gli amminoacidi disponibili come supporto alla crescita. L’analisi e la caratterizzazione tassonomica delle sequenze, ottenuta tramite l’impiego del software Qiime, ha permesso di ottenere informazioni sul numero di reads associate a ciascuna OTU per campione. A partire da 22 campioni derivati da due tempi di campionamento per 11 processi sono state identificate 24701 OTUs con una clusterizzazione al 97% di similarità di sequenza. Non tutti i taxa identificati sono riferibili a batteri proteolitici. Alcuni possono essere sviluppati impiegando i prodotti di fermentazione (es. acidi organici) di quei batteri “realmente” proteolitici (cross-feeding) o usando i pochi residui di fonti di carbonio presenti nell’inoculo fecale (es. mucina e fibre o polisaccaridi non digeriti).
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Abstract
The human gastrointestinal tract (GIT) is a complex environment, densely populated by hundreds species of bacteria (up to 1012 cells per g of intestinal content), archaea and eukaryotes. This research involves the application of the Next Generation Sequencing Technologies for two different studies targeted to a deeper comprehension of the gut ecosystem: the characterization of the fecal eukaryotic population and the identification of the groups of bacteria taking advantage on proteins and amino acids as carbon source. There are evidences that eukaryotes represent an important component of the gut microbiota, with beneficial or harmful roles, but this population of the human GIT remains relatively unexplored. Culture dependent methods showed that the total number of fungi in the feces of healthy subjects remains always under 105cells/g (Simon et al, 1984; Scanlan and Marchesi 2008), suggesting that they represent a small portion of the intestinal microbiota, but it is still unknown if this population carries out a permanent or a transient colonization. This project aimed to study the intestinal fungal population of 8 healthy adults comparing three different fecal samples in the time span of one year (time 0, after 3 month, 12 months). The composition of the fungal population, in terms of concentration and taxonomic assignment, has been explored with both culture dependent and independent methods. Metagenomic analysis of 14 out of 24 samples recognized 155 OTUs, corresponding to different species and genera of fungi. The majority was identified at genus level. Compared to the taxonomic analysis carried out on cultivable fungi, metagenome survey identified new genera, easily referable to the uncultivable fungi fraction.
The second part of this study focused on the GIT bacteria enriched on protein based media. Protein breakdown by commensal intestinal bacteria has major health effects, since it yields several harmful and toxic compounds (e.g. indoles, cresols, ammonia). To identify the main bacterial groups involved in intestinal catabolism of proteins, cultures of human gut microbiota were performed in an in vitro model, using a medium where proteins and peptones were the sole carbon source. The cultures were anaerobically incubated at 37°C (pH 6.8). The microbiota composition was determined at 0 and 6 h by Illumina sequencing. The first 6 h of the process were expected to be the time span corresponding to the major use of proteins and peptones as carbon and energy source. Then, changes in the composition of the microbial community were likely due to the proliferation of bacteria taking advantage by the availability of aminoacids to support growth. The analysis and the taxonomic characterization of the sequences performed by the software Qiime provided an OTUs table with the number of reads associated to each OTU per sample. The relative abundance was determined on the basis of the number of total reads per sample. As a whole, in the 22 samples coming from two time-points of 11 processes, 24701 OTUs were identified through the Qiime pipeline employing a clusterization at 97% of sequence similarity. Not all the taxa identified are proteolytic or amino acid fermenters. Some may have grown utilizing the fermentation products (e.g. the organic acids) produced by ‘true’ proteolytic members of the bacterial community, from which they depended in a cross-feeding relationship. Otherwise, they may have utilized residual carbon source occurring in the fecal inoculum (e.g. the mucin and indigested fibers or polysaccharides), even though the initial amount of fermentable carbohydrate was negligible compared to proteins and peptide.
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