Riassunto analitico
Lo studio svolto durante il periodo di tesi ha lo scopo di indagare l’influenza che il ponte disolfuro Cys46/Cys55 e la rete di interazioni non covalenti nella zona distale dell’eme esercitano sulla reattività della neuroglobina umana (hNgb) con il perossido di idrogeno (H₂O₂), che è un agente ossidante che si forma in condizioni di stress ossidativo cellulare. Per raggiungere tale obiettivo, sono stati studiati la hNgb nativa, i mutanti Y44A e Y44F, in cui la tirosina nativa in posizione 44 è stata sostituita rispettivamente con un’alanina e una fenilalanina, e le corrispondenti varianti prive del ponte disolfuro, grazie alla sostituzione delle Cys46 e Cys55 con altrettante alanine (C46A/C55A, Y44A/C46A/C55A, Y44F/C46A/C55A). L’accessibilità del gruppo eme da parte di molecole esogene (come H₂O₂) è stata indagata analizzando il legame dello ione cianuro al gruppo eme tramite spettroscopia elettronica, mentre la spettroscopia di dicroismo circolare è stata utilizzata per studiare la termostabilità delle proteine in esame. I fenomeni di aggregazione proteica causati dall’incubazione della hNgb con perossido di idrogeno, la massa molare e la natura degli aggregati proteici osservati sono stati analizzati mediante la combinazione di HPLC-SEC-PDA-MALS, SDS-PAGE e spettrometria di massa. Infine, la spettroscopia elettronica è utilizzata per testare l’attività pseudo-perossidasica della neuroglobina nativa e dei suoi mutanti, utilizzando come substrato l’ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid).
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