Riassunto analitico
INTRODUZIONE: Il tessuto adiposo (TA), fonte di cellule staminali/stromali mesenchimali (TA-CSM), può essere isolato tramite liposuzione e processato mediante differenti metodi. Questo consente il suo utilizzo in applicazioni di medicina rigenerativa, in particolare per il riparo di tessuti muscolo-scheletrici. Tra le tecniche usate ve ne è una basata sulla micro-frammentazione meccanica e un successivo reinnesto nel paziente con diverse applicazioni cliniche tra le quali l’osteoartrite.
SCOPO: Lo scopo di questa tesi è quello di valutare le interazioni tra il TA umano processato mediante micro-frammentazione e il liquido sinoviale (LS) quale modello di studio pre-clinico nel trattamento dell’osteoartrite del ginocchio.
MATERIALI E METODI: Sono stati sviluppati due modelli pre-clinici. Il primo consiste nella coltura tissutale ex-vivo per 24 ore e 5 giorni con LS di lipoaspirati processati mediante tecnica Lipogems. Il secondo si basa su colture cellulari bi-dimensionale (2D) e tri-dimensionale (3D) di TA-CSM addizionate di LS. In entrambi i modelli il controllo è stato ottenuto coltivando lipoaspirati e TA-CSM con il terreno di coltura α-MEM addizionato al lisato piastrinico (PLP). Le indagini sono state effettuate mediante colorazioni istologiche, immunoistochimica (IHC), qRT-PCR, colture cellulari e saggi metabolici.
RISULTATI: Sulla base dei risultati ottenuti dal primo modello il TA isolato con Lipogems mantiene la sua vitalità sino a 5 giorni ex-vivo, come attestato dagli elevati livelli di Ki67, dal mantenimento dell’espressione dei biomarker relativi a cellule progenitrici, quali il CD10 e CD90, e con una performance del tessuto indipendente dalla presenza di LS.
A fronte dell’elevata eterogeneità e complessità del TA ex-vivo, sono state effettuate ulteriori indagini molecolari volte a valutare lo stato di differenziamento del tessuto. È stata osservata una riduzione dell’espressione dell’mRNA di LPL (marker di differenziamento adipogenico) ed una espressione costante dell’mRNA di SOX9 (marker di differenziamento condrogenico), indipendentemente dallo stimolo con LS. Infine, al fine di valutare l’invecchiamento del TA, abbiamo preso come biomarker di riferimento un gene della famiglia HOX. In particolare si è osservato come i livelli di espressione del gene HOXB7 diminuiscano in coltura ed a seguito del trattamento con LS, mentre la sua espressione proteica, valutata con indagini di IHC, si dimostra mantenuta in tutti i casi analizzati con una tendenza ad aumentare a cinque giorni.
Al fine di approfondire il ruolo definito del LS sul TA è stato messo a punto un secondo modello incentrato sulla interazione tra il LS e le TA-CSM. Da queste indagini è emerso che il LS aumenta il tasso proliferativo delle TA-CSM, ne modifica la morfologia cellulare pur non alterando l’espressione di CD10 e CD90. Per quanto riguarda i marker del differenziamento, i livelli di mRNA di LPL e SOX9 restano costanti mentre il LS aumenta l’espressione della proteina HOXB7 con un concomitante calo dei livelli di mRNA di HOXB7.
CONCLUSIONI: Il LS preserva la fisiologia, la vitalità e l’architettura del TA anche dopo 5 giorni di co-coltura ex-vivo. Lo stato proliferativo, il comparto delle cellule staminali ed il processo di invecchiamento restano inalterati in seguito alla stimolazione con LS. Al contrario, l’interazione diretta tra il LS e le TA-CSM esaltano l’impatto biologico del LS sulle cellule sia in termini di proliferazione cellulare sia di potenziale rigenerativo. Questa tesi suggerisce come il LS sia in grado di preservare il TA umano ex-vivo contribuendo allo stesso tempo ad influenzare il suo compartimento staminale con meccanismi che, una volta chiariti, consentiranno di sinergizzare cellule e LS per scopi ricostruttivi in pazienti affetti da osteoartrite.
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