• CRISPR-Cas9
• Genome Editing
• MAGE-A1
• T cells
• TCR-engineering

CRISPR/Cas9 rappresenta uno strumento efficace per l'editing del genoma e le sue applicazioni spaziano dalla ricerca di base a potenziali strategie terapeutiche. Il complesso Cas9-gRNA induce un taglio a doppio filamento nella sequenza di DNA bersaglio innescando dei meccanismi cellulari di riparazione del DNA, come il sistema di giunzione delle estremità non omologhe (NHEJ) che porta all'interruzione del codice di lettura del gene o la ricombinazione omologa (HDR), che consente l’integrazione di una sequenza di interesse in un punto preciso del genoma. Negli ultimi anni il sistema CRISPR/Cas9 è stato applicato nel campo dell'immunoterapia per indurre e potenziare la risposta immunitaria contro il cancro. La strategia di sostituzione ortotopica del recettore delle cellule T (TCR) si basa sull'ingegnerizzazione dei linfociti T mediante CRISPR/Cas9 per sostituire il TCR nativo con uno sintetico che riconosce gli antigeni specifici del tumore.

Questa tesi descrive una strategia di sostituzione ortotopica del TCR in linfociti T, mediante CRISPR/Cas9, per interrompere l'espressione del TCR endogeno e contemporaneamente indurre il knock-in di uno stampo di DNA che codifica per il TCR specifico per l'antigene MAGE-A1 (MA1 TCR). Lo scopo della tesi è dimostrare l'efficacia di linfociti T umani ingegnerizzati con un TCR specifico per MAGE-A1 in grado di uccidere cellule di melanoma metastatico che esprimono tale antigene. Per eliminare il TCR endogeno e indurre l'espressione di un TCR specifico per MAGE-A1, i linfociti T isolati da donatori sani sono stati trattati con ribonucleoproteine (RNP) composti da un gRNA specifico per il locus della catena α (TRAC) e la proteina SpCas9 derivata da Streptococcus pyogenes, in combinazione con il DNA stampo per la ricombinazione omologa. Il DNA stampo consisteva in un DNA lineare a doppio filamento che contiene l'intera catena β del TCR e parte della catena α del TCR specifica per MAGE-A1, fiancheggiata da braccia di omologia per ottenere l’integrazione del donor nell'esone 1 del locus TRAC. Inoltre, per ridurre il potenziale rischio di mis-appaiamento tra il recettore transgenico e le catene TCR endogene, il knockout delle catene TCR β endogene è stato ottenuto mediante un gRNA specifico per l'esone 1 di TRBC1 e TRBC2 complessato in RNP con la proteina SpCas9. L'efficienza di knock out nel locus TRAC è stata superiore al 90% e quasi dell'80% per entrambi i loci TRBC1/TRBC2. I riarrangiamenti cromosomici tra i loci TRAC e TRBC risultanti dall'editing multiplo sono stati rilevati mediante PCR. Per valutare l'espressione del MA1 TCR sulla superficie dei linfociti T, sono stati eseguiti analisi di citometria a flusso che hanno mostrato che l'11,5% delle cellule CD3+ e più del 14% dei linfociti CD8+ esprimevano il TCR specifico per MAGE-A1. È interessante notare che i linfociti T ingegnerizzati rappresentavano il 69% e l'85% delle cellule TCR+, rispettivamente nelle popolazioni CD3 e CD8.
I linfociti T ingegnerizzati sono stati analizzati per la loro attività citotossica contro le cellule di melanoma metastatico che esprimono MAGE-A1, che sono state trasdotte con un vettore lentivirale contenente una cassetta di espressione per GFP, in maniera tale da seguire il destino delle cellule bersaglio. L'analisi al citofluorimetro della popolazione GFP+ presente nella co-coltura di cellule T ingegnerizzate ha dimostrato che le cellule T esprimenti MA1-TCR erano in grado di uccidere le cellule di melanoma metastatico. In conclusione, questa tesi dimostra che i linfociti T ingegnerizzati mediante l'applicazione del sistema CRISPR/Cas9 per la sostituzione ortotopica del TCR sono in grado di riconoscere e uccidere le cellule di melanoma metastatico che esprimono diversi livelli di antigene tumorale MAGE-A1.

CRISPR/Cas9 technology provides an efficient tool for genome editing and its applications range from basic research to potential therapeutic strategies. The Cas9-gRNA complex induces a double-strand break (DSB) in the target DNA sequence, which could be repaired by Non-Homologous End Joining (NHEJ) leading to gene disruption, or Homology-Directed Repair (HDR) in presence of a DNA donor template, to introduce a desired sequence into a target region. In the last years CRISPR-Cas9 has been applied in the cancer immunotherapy field to induce and enhance the immune response against cancer. The orthotopic T cell receptor (TCR) replacement strategy relies on the CRISPR-based engineering of T cells to substitute the native TCR with a synthetic one that recognizes tumor-specific antigens. This thesis describes the application of CRISPR/Cas9-mediated orthotopic TCR replacement in primary T cells to disrupt endogenous TCR expression and simultaneously induce the knock-in of a DNA donor template for therapeutic TCR targeting the cancer/testis antigen MAGE-A1 (MA1-TCR). This antigen is highly expressed in various cancers, including melanoma, thus representing an attractive target for immunotherapy. The aim of the thesis is to demonstrate the efficacy of human primary T cells engineered with a TCR specific for MAGE-A in killing metastatic melanoma cells expressing that antigen. To knock-out the endogenous receptor and induce the expression of a TCR specific for MAGE-A1, T cells isolated from healthy donors were treated with ribonucleoprotein (RNP) complexes of a gRNA targeting the α chain locus (TRAC) and Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9), in combination with the HDR donor template. The donor template consisted in a linear dsDNA carrying the full TCR β-chain and part of TCR α-chain specific for MAGE-A1, with flanking left and right homology arms for precise insertion into the TRAC exon 1 locus. Moreover, to reduce the potential risk of mispairing between the transgenic receptor and the endogenous TCR chains, the knockout of endogenous TCR β chains was achieved through a gRNA specific for TRBC1 and TRBC2 exon 1, delivered with SpCas9 as RNP. Primary T cells electroporated with RNPs for TRAC, TRBC1/2 loci and DNA donor template, were analyzed by genomic assays and flow cytometry to verify the editing efficiency and T cell functionality. The knockout efficiency in the TRAC locus was higher than 90%, and nearly 80% for both TRBC1/TRBC2 loci. Chromosomal rearrangements between the TRAC and TRBC loci resulting from the multiplex Cas9 editing were detected by PCR. To evaluate the expression on T cell surface of MAGE-A1-specific TCR, flow cytometry analyses were performed and showed that 11.5% of CD3+ cells and more than 14% of CD8+ lymphocytes expressed MAGE-A1-specific TCR. Interestingly, engineered T cells represented the 69% and 85% of the TCR+ cells in the CD3 and CD8 compartments, respectively. Next, engineered T cells were analyzed for their cytotoxic activity against MAGE-A1-expressing metastatic melanoma cells, which had been previously transduced with a lentiviral vector carrying an expression cassette for GFP to induce the expression of the reporter gene in the target cells. Flow cytometric analysis of the residual GFP+ target population in co-culture of engineered T cells with metastatic melanoma cells showed that MA1-TCR expressing T cells were able to kill metastatic melanoma cells even though the susceptibility of target cells to the cytotoxic activity of T cells was not directly correlated to expression level of MAGE-A1 cancer antigen. In conclusion, this thesis shows that T cells CRISPR-engineered for orthotopic TCR replacement are able to recognize and kill metastatic melanoma cells expressing different level of MAGE-A1 cancer antigen.