Riassunto analitico
Lo sviluppo del cervello umano è un meccanismo complesso che inizia durante la formazione dell’embrione e richiede anni per essere completato. Dopo la neurogenesi, i progenitori multipotenti cambiano i propri programmi di sviluppo generando astrociti e oligodendrociti, che supportano la sopravvivenza dei neuroni, partecipano alla formazione delle sinapsi e generano mielina. Le cellule pluripotenti indotte umane (hiPSC) hanno permesso di sviluppare modelli di neurogenesi e gliogenesi in vitro. La derivazione di hiPSC da pazienti affetti da disturbi del SNC e lo sviluppo di protocolli per differenziare queste cellule in neuroni e hanno permesso di studiare meccanismi patologici e sviluppare terapie. Mentre le colture in 2D basate su hiPSC comunemente utilizzate sono vantaggiose nello studio di specifiche popolazioni neuronali e/o gliali, per ricapitolare più fedelmente la complessità morfologica e funzionale del cervello umano in via di sviluppo sono necessari sistemi sperimentali alternativi. Gli organoidi cerebrali possono offrire una alternativa. Di fatto, sono strutture in 3D, auto-organizzate, derivate da hiPSC, che ricapitolano la generazione, la proliferazione e il differenziamento dei progenitori neurali in neuroni e cellule gliali, imitando le complesse interazioni tra i diversi tipi di cellule emergenti nel cervello in via di sviluppo. Il laboratorio ospitante è interessato allo studio dei meccanismi patologici del SNC coinvolti in rare malattie genetiche demielinizzanti (es. Leucodistrofie). Precedenti studi, svolti utilizzando colture neuronali/gliali derivate da hiPSC hanno suggerito un dificit nel differenziamento neuronale e oligodendrogliaiale nelle cellule dei pazienti leucodistrofici. Tuttavia, i limiti del sistema 2D hanno ostacolato un'analisi più accurata del fenotipo oligodendrogliale, che potrebbe essere analizzato più approfonditamente in un sistema 3D. Infine, studi recenti descrivono protocolli per la generazione di organoidi cerebrali arricchiti in cellule gliali, inclusi oligodendrociti maturi mielinizzanti.
Il mio lavoro di tesi si incentra sullo sviluppo e ottimizzazione di un recente protocollo per generare sferoidi derivati da hiPSC arricchiti di oligodendrociti (hOLS) che ricapitolano le fasi di sviluppo del cervello passando da neurogenesi (che si verifica nella fase iniziale di differenziazione) a gliogenesi, caratterizzata dalla formazione di astrociti e oligodendrociti maturi.
Ho usato iPSC derivate da donatori sani per generare gli hOLS. Il protocollo è progettato per indurre inizialmente la formazione del neuroepitelio e poi promuovere specificazione, proliferazione e sopravvivenza degli oligodendrociti mediante fattori di crescita, piccole molecole e ormoni. Ho generato hOLS con buona efficienza e riproducibilità. Gli hOLS sono stati mantenuti in coltura per 160 giorni al fine di consentire la maturazione dell’oligodendroglia e sono stati caratterizzati in diversi momenti per l'espressione di marcatori specifici per i vari lignaggi cellulari con la real-time PCR e il saggio di immunofluorescenza. Questa analisi ha mostrato la soppressione nel tempo dei geni associati alla pluripotenza e la concomitante sovraregolazione dei marcatori di progenitori neurali (ad esempio Nestina), seguiti dalla sovraregolazione dei marcatori neuronali (ad esempio MAP2, NF200), astrogliali (ad esempio GFAP) e oligodendrogliali (ad esempio MBP). Sono state osservate cellule MBP+ in stretta vicinanza alle proiezioni neuronali NF200+, suggerendo la formazione di appropriate connessioni neuroni-oligodendrociti.
Questo modello 3D umano in vitro sarà applicato per future indagini con hiPSC da pazienti, per studiare potenziali difetti nello sviluppo neurologico e le complesse interazioni cellulari neuroni-glia e glia-glia responsabili dell'insorgenza e della progressione della malattia nelle leucodistrofie, possibilmente favorendo lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici.
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Abstract
The human brain development is a complex mechanism that starts early in the embryo and takes years to complete. After neurogenesis, the multipotent neural progenitors switch their developmental programs toward the generation of astrocytes and oligodendrocytes, which support neuronal survival, participate in synapse formation, and generate myelin.
The recent advent of human induced pluripotent cells (hiPSC) technologies has allowed to develop in vitro models of human neurogenesis and gliogenesis. The derivation of hiPSC from patients affected by CNS disorders and the development of protocols to differentiate these cells into neurons and glia has been key to study the mechanisms of disease and to develop therapies. While the commonly used hiPSC-based two-dimensional (2D) cultures are advantageous in studying specific neuronal and/or glial populations, alternative experimental systems are required to recapitulate more faithfully the morphological and functional complexity of the developing human brain. Human brain organoids can offer such system. In fact, they are hiPSC-derived self-organizing structures that recapitulate the generation, proliferation, and differentiation of neural progenitors into neurons and glial cells, mimicking the complex interactions among the diverse, emergent cell types of the developing brain in three-dimensions (3D).
The host laboratory is interested in studying the mechanisms of CNS pathology in rare genetic demyelinating disorders (i.e. leukodystrophies). Previous studies using hiPSC- derived neuronal/glial cultures suggested a defective neuronal and oligodendroglial differentiation in leukodystrophy patient’s cells. However, the limitations of the 2D system hampered a more accurate analysis of the oligodendroglial phenotype, which could be better analyised in a 3D system. Importantly, recent studies describe protocols for the generation of brain organoids enriched in glial cells, including mature myelinating oligodendrocytes.
My thesis work was focused on the development and optimization of a recently published protocol to generate hiPSC-derived oligodendrocyte spheroids (hOLS) that recapitulate the stages of brain development transitioning from neurogenesis (occurring in the early step of differentiation) to gliogenesis, characterized by the formation of astrocytes and mature myelinating oligodendrocytes.
I used iPSCs derived from healthy donors to generate hOLS. The protocol is designed to first induce neuroepithelial commitment and then promote the commitment, proliferaton and survival of oligodendroglial cells by means of growth factors, small molecules and hormones. I generated hOLS with good efficiency and reproducibility. The hOLS were maintained in culture for 160 days to allow the maturation of oligodendroglia and were characterized at different time points for the expression of lineage-specific markers using the Real-Time PCR and immunofluorescence analysis. Results of this analyses showed the time-dependent downregulation of pluripotency associated genes, and the concomitant upregulation of neural progenitor markers (e.g. Nestin) followed by upregulation of neuronal markers (e.g.MAP2, NF200) and, ultimately of astroglial (e.g. GFAP) and mature oligodendroglial markers (e.g. MBP). Importantly, we found MBP+ cells in close proximity to NF200+ neuronal projections, suggesting proper neuronal-oligodendroglial connections.
This human in vitro 3D model will be applied for future investigations in patient-derived hiPSC, to provide insights on the potential neurodevelopmental defects and the complex cellular neuron-glia and glia-glia interactions responsible of disease onset and progression in leukodystrophies, possibly favoring the development of novel therapeutic approaches.
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