Riassunto analitico
Lo studio svolto durante il periodo di tesi è volto a definire e caratterizzare il processo di esposizione della Neuroglobina, una proteina presente nelle cellule della retina e neuronali, a condizioni di stress ossidativo promosso da agenti ROS (Reacting Oxygen Species). In questa tesi è stata usata acqua ossigenata come agente esogeno: essa è in grado di ossidare il gruppo eme, presente come sito attivo nella Neuroglobina, con la conseguente uscita del ferro dal piano dello stesso. Lo studio è stato condotto, inoltre, su cinque mutanti di tale proteina: la wild type con la mutazione delle due cisteine coinvolte nella formazione del punte disolfuro, sostituite con due alanine (C46AC55A); la proteina mutata in posizione 44, sostituendo una tirosina con un alanina, utilizzata tal quale e con l’aggiunta della mutazione sul ponte (Y44A e Y44AC46AC55A); infine con la mutazione sempre della tirosina 44 ma questa volta sostituita da una fenilalanina, sempre usata tal quale e con il corrispettivo mutante senza il ponte disolfuro (Y44F e Y44FC46AC55A).
Sono state quindi condotte su tali mutanti misure di spettroscopia UV-visibile per osservare la cinetica di degradazione dell’eme: infatti è visibile una diminuzione del valore di assorbimento della banda di Soret (412 nm), all’aumentare del tempo dell’esposizione della proteina all’acqua ossigenata, con variazione di velocità e comportamento a seconda delle mutazioni apportate.
L’ulteriore analisi che è stata eseguita su tale processo riguarda la caratterizzazione della forma degli aggregati, che si vengono a formare in tali condizioni di stress ossidativo: mediante misure di spettroscopia infrarossa (IR) e di fluorescenza si è voluto stabilire se gli amiloidi, presenti a seguito dell’ossidazione con acqua ossigenata, risultano essere corpi amorfi (privi di una struttura ordinata) oppure di natura fibrillare. La struttura degli aggregati è stata osservata anche tramite fotografie acquisite mediante microscopia a forza atomica (AFM), depositando la proteina esposta all’acqua ossigenata su mica.
L’importanza di tale indagine si ritrova nella possibile tossicità legata appunto a tali strutture fibrillari: è infatti presente a livello delle retino-patie una amiloidosi ed è noto che diverse patologie neurodegenerative (quali morbo di Alzheimer, Parkinson etc..) siano conseguenti alla formazione di aggregati fibrillari.
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