Riassunto analitico
La tecnologia CRISPR/Cas9 fornisce uno strumento semplice e adattabile per ottenere modificazioni genomiche. Le nucleasi Cas9 introducono specifici tagli a doppio filamento (DSB) nel DNA che stimolano i meccanismi di riparo del DNA, come la ricombinazione omologa (HR) e il non-homologous end joining. La proteina Cas9 di Streptococcus pyogenes (SpCas9) è stata ingegnerizzata per ottenere una nucleasi umanizzata che richiede soltanto una semplice guida a RNA (sgRNA) disegnata su misura per effettuare un DSB in un sito specifico del DNA. Le modificazioni genomiche tramite CRISPR sono state ideate principalmente per correggere malattie monogeniche, tuttavia, negli ultimi anni, si sono estese anche all’ingegnerizzazione di linfociti T per immunoterapia cellulare. L’immunoterapia antitumorale ha come obiettivo la stimolazione del sistema immunitario per combattere i tumori. Esistono diverse strategie per potenziare l’attività antitumorale del sistema immunitario: una di queste è l’ingegnerizzazione di cellule T con lo scopo di esprimere un recettore specifico per antigeni tumorali. Ad oggi, l’ingegnerizzazione di cellule T con un TCR specifico per un antigene tumorale sembra una strategia promettente per il trattamento dei tumori solidi.
In questa tesi si sfrutta la HR mediata da CRISPR/Cas9 per sostituire il TCR endogeno con un TCR specifico per il riconoscimento dell’antigene tumorale NY-ESO-1 nei linfociti T derivanti da donatori sani con aplotipo HLA-A*0201, il più comune nella popolazione caucasica. L’antigene NY-ESO-1 appartiene ai cancer/testis antigens, i quali sono espressi da diversi tumori solidi. Lo scopo della tesi è dimostrare che le cellule T primarie ingegnerizzate con un TCR specifico per NY-ESO-1 sono in grado di eliminare cellule appartenenti a linee tumorali che esprimono quell’antigene. È stato eseguito un’analisi su diverse linee tumorali per verificare l’espressione di NY-ESO-1 tramite RT-PCR. I linfociti T sono stati purificati dal sangue periferico dei donatori sani, isolando le cellule CD3+ attraverso una selezione immunomagnetica negativa dei PBMC. È stato utilizzato un crRNA specifico per l’esone 1 del sito TRAC in associazione con la SpCas9 Alt R per indurre la ricombinazione omologa. Il templato donatore consiste in un dsDNA lineare che reca la catena completa TCR β e parte della catena TCR α fiancheggiate da due regini di omologia che permettono un inserimento preciso tramite HR nel sito modificato da CRISPR/Cas9; entrambe le catene sono specifiche per il riconoscimento di un peptide di NY-ESO-1 caricato su tetrameri MHC-I HLA-A*0201. Le cellule T primarie, dopo essere state attivate con PHA e IL-2, sono state co-elettroporate con delle ribonucleoproteine di SpCas9-sgRNA assieme al templato donatore. L’efficienza di modificazione nel sito TRAC è stata superiore al 90%, misurata in base ad analisi TIDE. Come atteso, è stata osservata tramite analisi citofluorimetrica una riduzione analoga dell’espressione del TCR. L’inserimento specifico del templato donatore nell’esone 1 del sito TRAC è stata valutata tramite PCR sulle regioni al 3’ e 5’ del sito di taglio; l’inserimento atteso è stato verificato tramite sequenziamento. Per valutare l’efficienza di sostituzione del TCR, le cellule T trattate sono state marcate con dei tetrameri MHC-I caricati con il peptide di NY-ESO-1 e analizzate tramite citofluorimetria. Successivamente le cellule T ingegnerizzate sono state isolate tramite FACS e poste in coltura con linee cellulari tumorali che esprimono NY-ESO-1. Tramite citofluorimetria si è quindi valutata la capacità di eliminazione di queste cellule da parte dei linfociti T ingegnerizzati. In conclusione, questa tesi mostra una prova di principio per la sostituzione del TCR in linfociti T primari senza l’impiego di vettori virali.
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Abstract
CRISPR/Cas9 technology provides a simple and highly customizable tool for genome editing. RNA-guided Cas nucleases introduce specific double strand breaks (DSB) in the DNA triggering the cellular DNA repair mechanisms, such as the homologous recombination (HR) and the non-homologous end joining. The Cas9 from Streptococcus pyogenes (SpCas9) has been engineered to obtain a humanized nuclease which requires only a tailor-made single guide RNA (sgRNA) to exert a site specific DSB in the DNA. CRISPR genome editing was mainly designed for correcting inherited monogenic disease, however, in the last years, has gained a widespread application in T cell modification for adoptive cell immunotherapy. Cancer immunotherapy aims to arm the immune system to fight tumors. There are several strategies to boost the antitumor activity of the immune system and the engineering of T cells to express receptors specific for tumor antigens represents a valuable strategy in cancer immunotherapy. To date, the engineering of T cells with a tumor antigen-tailored TCR seems to be promising for the treatment of solid tumors.
This thesis employs the CRISPR/Cas9-mediated HR to orthotopically replace the endogenous TCR with a TCR specific for the recognition of the NY-ESO-1 tumor antigen in T lymphocytes from healthy donor having the HLA-A*0201 haplotype, the most common one in the Caucasian population. The NY-ESO-1 antigen belongs to cancer/testis antigens which are expressed by several solid tumors. The aim of the thesis is to demonstrate that human primary T cells engineered with a TCR specific for NY-ESO-1 are able to kill cancer cell lines expressing that antigen. Several cancer cell lines have been screened to assess the NY-ESO-1 expression by RT-PCR. T cells have been purified from peripheral blood of healthy donors, isolating CD3+ cells through an immunomagnetic negative selection of PBMC. A crRNA targeting the exon 1 of TRAC locus has been employed together with the Alt R SpCas9 to trigger the HR. The donor template consists in a linear dsDNA carrying the full TCR β chain and part of a TCR α chain flanked by homology arms that allow the precise insertion by HR into the CRISPR/Cas9-edited locus. Both chains are specific for the recognition of the NY-ESO-1 antigenic peptide loaded on HLA-A*0201 MHC-I tetramer. SpCas9-sgRNA ribonucleoproteins coupled to the HR donor template have been electroporated to primary T cells, upon activation with PHA and IL-2. The editing efficiency in the TRAC locus was higher than 90% by TIDE analysis. As expected, a comparable downregulation of TCR expression, evaluated through a cytofluorimetric assay, was observed. The specific insertion of the donor template into the exon 1 of TRAC locus has been evaluated by a 5’ and 3’ targeted integration PCRs and confirmed by sequencing. To evaluate the frequency of the precise TCR replacement, the treated T cells were stained with NY-ESO-1-loaded MHC-I tetramers and analysed by flow cytometry. Next, engineered T cells have been isolated through a FACS sorting and co-cultured with NY-ESO-1 expressing cancer cell lines. The killing activity of the TCR-engineered T cells has been evaluated by flow cytometry. In conclusion, this thesis represents a proof-of-principle application of CRISPR/Cas9 system to non-viral TCR replacement for targeting cancer cells.
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