Riassunto analitico
Spettrometria di massa e si è evoluta in una potente piattaforma bioanalitica per la misurazione simultanea di un gran numero di proteine espresse in cellule e tessuti ed è diventato uno strumento importante per la scoperta di nuovi biomarcatori utili per l'applicazione clinica.
Il mio lavoro è focalizzato sulla valutazione delle proteine folato-dipendenti come target di farmaci e biomarcatori. In particolare ho seguito due sottoprogetti principali: A) lo studio delle modulazioni proteiche dopo terapia farmacologica in campioni clinici da pazienti affetti da tumore ovarico. Lo scopo era quello di monitorare il set di proteine associato al meccanismo di azione del farmaco, che hanno un ruolo come biomarker precoci di farmacodinamica. B) l'identificazione delle proteine modulate dopo trattamenti farmacologici anti-Leishmania per la caratterizzazione del set di proteine modulate.
In entrambi i progetti l'obiettivo finale era quello di comprendere meglio il meccanismo d'azione e identificare delle proteine associate per la terapia combinata di farmaci e nuovi obiettivi per lo sviluppo di farmaci.
Nel primo progetto A) il Pemetrexed è stato utilizzato dopo la prima linea di trattemento su campioni di tessuti ovarici di pazienti affetti da tumore ovarico epiteliale resistente al platino (PR-EOC).
Un approccio proteomico differenziale è stato sviluppato per identificare le proteine espresse in modo differenziato (DEPs). È stata applicata una combinazione di studi proteomici e bioinformatici. Dopo l'analisi dei dati, è stato identificato un gruppo di 24 proteine caratterizzanti la risposta al Pemetrexed. Il metodo applicato e il flusso di lavoro sviluppato includevano una serie di proteine di riferimento come un nuovo strumento per aiutare la validazione delle proteine.
La seconda parte del progetto A) è stato basato sull'analisi di proteine modulate dal 5-FU per monitorare l'efficacia della terapia in uno studio retrospettivo su campioni di siero provenienti da pazienti con tumore ovarico epiteliale ricorrente (EOC) trattati con il farmaco dopo diversi altri trattamenti e per valutare la risposta precoce per ogni paziente.
Più di 200 proteine sono risulatate differenzialmente modulate dal trattamento col 5-FU. Confrontando i campioni di siero basale, sono state identificate tre DEPs tra i pazienti rispondenti alla terapia e quelli non rispondenti. Una seconda analisi differenziale è stata eseguita tra prelievi post e pretrattamento su ciascun paziente su campioni raccolti in diversi tempi durante la chemioterapia consentendo l'identificazione di 14 proteine che potrebbero essere possibili biomarcatori farmacodinamici di efficacia farmacologica.
Tra questi, la proteina FHR1 ha mostrato un comportamento specifico. È coinvolto nella regolazione del complemento e può svolgere un ruolo sulla protezione delle cellule tumorali contro l'attacco immunitario. Il progetto B) focalizzato sull'identificazione del profilo proteico associato all'azione di due agenti anti-Leishmania. La disponibilità di proteine parassitarie mostra una limitata caratterizzazione nei database e la loro funzione non è classificata. Nel nostro caso, sono state quantificate 406 proteine. Sono state ottenute 17 DEPs e il loro coinvolgimento nel meccanismo di azione del H0080 è in corso. In un secondo studio su Miltefosine, milte1 e milte2, abbiamo identificato DEPs, modulate dai tre trattamenti nella stessa direzione e coinvolti in diversi processi biologici. Ciò ha suggerito quali componenti erano rilevanti per lo sviluppo di resistenza ai farmaci e quali nuovi bersagli potrebbero essere identificati.
Un terzo sottoprogetto è correlato allo screening biologico di nuovi inibitori di anti-timidilato sintasi in cui sono stati identificati nuovi composti.
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Abstract
Mass spectrometry (MS) Proteomics has evolved into a very powerful bioanalytical platform for the simultaneous measurement of a large number of proteins expressed in cells and tissues, and has become an important tool for the discovery of new biomarkers useful for clinical application.
My work is focused on the evaluation of folate dependent proteins as drug targets and biomarkers. In particular, I followed two types of projects: a) studies of protein modulations following drug therapy in clinical samples from patients affected by ovarian cancer. The aim was to track the protein set associated to the drug mechanism of action and to be used as an early pharmacodynamics biomarker. b). tracking of the protein modulations associated with anti-Leishmania drug treatments for the characterization of a relevant protein set.
The aim of both projects was to understand more of the mechanism of action for drug combinations and identify the connected relevant proteins, as well as discover novel targets for drug development.
In the first project, Pemetrexed was used after the first-line therapy on ovarian tissue samples from patients affected by platinum-resistant epithelial ovarian cancer (PR-EOC). A differential proteomic approach was developed in order to identify the Differentially Expressed Proteins (DEPs). A combined proteomic and bioinformatic approach was employed. After network data analysis, we identified a panel of 24 proteins that characterize the response to Pemetrexed. The method applied and workflow developed included a protein set of reference as a new tool to help protein validation.
A second project of the first type was based on the analysis of 5-FU-modulated proteins to track the drug efficacy in therapy within a retrospective study on serum samples from recurrent epithelial ovarian cancer (EOC) patients treated with the drug after multiple other treatments and to evaluate the early response for each patient. More than 200 proteins were differentially modulated after 5-FU treatment. Comparing the basal serum samples, three DEPs between responder and not-responder patients were discovered. A second differential analysis between post and pre-treatment on each patient was performed on samples collected at different times of chemotherapy schedule and allowed the identification of 14 proteins that could represent a potential pharmacodynamic biomarker of drug efficacy. Among them, the FHR1 protein showed a specific behavior. It is involved in complement regulation and may play a role on the protection of ovarian tumor cells against humoral immune attack.
Project b) focused on the identification of the protein profile associated with the action of two anti-Leishmania agents. Parasitic proteins availability show a limited characterization and annotation in databases and often their function is not classified. In our case, 406 proteins were identified and quantified. 17 modulated proteins were obtained and their involvement in the mechanism of action compound H0080 is under investigation. In a second study upon Miltefosine, milte1 and milte2 treatments, we identified 35 differentially expressed proteins that are modulated by three treatments in the same direction and are involved in several biological processes. This suggested which components were relevant for drug resistance development and the identification of new targets.
A third sub-project was related to the biological screening of new thymidylate synthase inhibitors in which new leads were identified.
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