• bio-based materials
• downstream process
• marine proteins
• molecular dynamics
• protein expression

I materiali polimerici protagonisti della nostra vita quotidiana, così come di diverse applicazioni industriali e tecnologiche, sono molto spesso derivati dal petrolio e di conseguenza dannosi per noi e per il pianeta. In sostituzione a questi, i materiali naturali, come per esempio quelli di origine proteica, rappresentano un promettente materiale di partenza per lo sviluppo di biopolimeri sostenibili grazie alla facilità con cui si possono produrre, manipolare e trasformare. Essi possiedono inoltre caratteristiche peculiari, tra cui la loro intrinseca biodegradabilità e proprietà meccaniche che combinano forza ed estensibilità. Questa tesi magistrale si focalizza sulla produzione di una proteina appartenente alla famiglia delle suckerins e sullo studio della struttura e del processo di aggregazione di un ottapeptide derivante dalla famiglia delle proteine reflectins. Entrambe le famiglie proteiche sono naturalmente espresse dai cefalopodi, rispettivamente nei denti delle ventose dei calamari e nei tessuti riflettenti, e possono essere utilizzate per produrre materiali bio-ispirati ed ingegnerizzati adatti a diverse applicazioni.
Nella prima parte del progetto sono state ottimizzate le condizioni per l’espressione di una proteina appartenente alla famiglia delle suckerins (S14) ed espressa naturalmente da Dosidicus gigas, in Escherichia coli BLR(DE3). La proteina target è stata ottenuta all’interno dei corpi di inclusione e sono state testate diverse tecniche di purificazione: lavaggio dei corpi di inclusione seguito dal metodo “pH-cycling” (precipitazione selettiva della proteina cambiando il pH) e cromatografia in fase inversa attraverso HPLC. In particolare, il lavaggio dei corpi di inclusione non ha permesso di ottenere un adeguato livello di purezza di S14, ma la successiva purificazione attraverso “pH-cycling” o cromatografia in fase inversa lo ha migliorato rispettivamente fino al 99.2% e 100%, con rese stimate di 65.7% e 60.8%. Tuttavia, il metodo “pH-cycling” ha mostrato una bassa riproducibilità, mentre il campione purificato ottenuto dalla cromatografia in fase inversa aveva un basso contenuto proteico. Per questo motivo, sarà necessaria un’ulteriore ottimizzazione volta a migliorare la resa della fase di downstream della proteina target, al fine di ottenere una quantità di proteina sufficiente per la produzione di biomateriali.
Nella seconda parte del progetto sono state utilizzate tecniche in silico per lo studio su scala atomica del processo di aggregazione di un ottapeptide derivante dalla sequenza delle proteine reflectins. Attraverso l’impiego del database online ZipperDB è stato possibile identificare all’interno della sequenza peptidica tre possibili patterns con un’elevata propensione all’aggregazione. Questi sono stati utilizzati per creare dei bundle, successivamente valutati attraverso simulazioni di dinamica molecolare. Questi studi hanno permesso di acquisire una migliore conoscenza del pattern di aggregazione del peptide senza l’aggiunta di additivi esterni, indispensabile per lo sviluppo di biomateriali basati su di esso o sulle proteine reflectins. I risultati di questo lavoro sono stati inclusi in un articolo (in preparazione) e sono stati esposti in un poster e in una presentazione di una conferenza internazionale.

Polymeric materials commonly used in our daily lives, as well as in industrial settings and advanced technologies, are mostly derived from petroleum feedstocks, presenting toxicity to humans and living environments. Peptide and protein-based materials found in nature are an attractive model for the design of bio-based materials because of their easy production, manipulation and processing and their several interesting features, such as mechanical properties that combine strength and extensibility and their intrinsic biodegradability. This master thesis focuses on the production of a protein from the suckerin family and on the structural and self-assembly studies of an octapeptide from the reflectin protein family. Both protein families are naturally expressed by cephalopods – in the sucker ring teeth and in reflective skin tissues, respectively - and can yield bioinspired engineered materials for diverse applications. In the first part of the project, the conditions for the recombinant expression of a Dosidicus gigas suckerin protein (S14) in Escherichia coli BLR(DE3) were optimised, leading to its production in inclusion bodies (IB). Several protein purification techniques were tested: IB clean-up followed by “pH-cycling” method (selective protein precipitation with pH) or reverse-phase chromatography in HPLC. In particular, IB clean-up was not enough to improve S14 purity. The following purification with “pH-cycling” method or reverse-phase chromatography further improved the purity level up to 99.2 % and 100 %, with estimated yields of 65.7 % and 60.8 %, respectively. Nevertheless, it was concluded that the “pH-cycling” method has a low reproducibility, while the purest sample obtained from reverse phase chromatography had a low protein content. Therefore, further optimisations will be necessary to improve the yield of the downstream processing of S14 to produce enough protein for materials production. The second part of the project focused on the in silico atomic-scale study of a peptide self-assembly, an octapeptide from reflectin proteins sequence. The use of ZipperDB online database permitted to identify three possible patterns with higher aggregation propensity within the peptide sequence, that were subsequently used to create bundles for evaluating of their behaviour through Molecular Dynamics simulations. These studies enabled a deeper insight of the peptide self-assembly aggregation pattern without external additives. This comprehension is indispensable for the development of novel materials produced based on this peptide. Finally, the main conclusions of this work were incorporated in a manuscript (in preparation) and exposed in a poster and an oral communication in an international conference.