Riassunto analitico
I prodotti naturali sono miscele complesse di composti bioattivi (denominati metaboliti secondari), i quali, spesso, agiscono sinergisticamente. Per poter garantire l'affidabilità e la sicurezza di questi prodotti e per potenziarne il controllo di qualità, è fondamentale identificare tutti i componenti del fitocomplesso. In quest’ottica, lo sviluppo di metodi analitici avanzati che permettano un’accurata analisi dei composti bioattivi riveste enorme importanza. Alla luce di ciò, il mio Dottorato di Ricerca ha avuto come obiettivo lo sviluppo di tecniche analitiche efficienti ed innovative per l'analisi dei metaboliti secondari bioattivi in diversi prodotti naturali, tra cui due piante di interesse nutraceutico (Punica granatum L. e Vaccinium myrtillus L.) e una pianta di interesse farmaceutico (Cannabis sativa L.). Inizialmente è stato sviluppato un nuovo metodo analitico per il metabolite fingerprinting dei polifenoli contenuti nel succo e nelle bucce di P. granatum L.. L’analisi qualitativa e quantitativa dei metaboliti secondari è stata effettuata mediante analisi RP-HPLC-UV / DAD e RP-HPLC-ESI-MS e MS2. L'applicazione della tecnologia fused-core della fase stazionaria ha consentito di ottenere un miglioramento delle prestazioni cromatografiche rispetto a quelle ottenute utilizzando fasi stazionarie convenzionali. Rimanendo nell’ambito dei composti polifenolici, è stato effettuato il metabolite profiling delle antocianine nelle bacche di V. myrtillus L. e in prodotti alimentari derivati per valutarne la qualità. A questo scopo sono state condotte analisi RP-HPLC con rivelazione UV / DAD ed ESI-MS. Per quanto riguarda l'attività biologica, gli estratti ottenuti dai mirtilli sono stati sottoposti a esperimenti in vivo per testare l'attività antiossidante delle antocianine, utilizzando il modello del Caenorhabditis elegans, in collaborazione con Prof. Celestino Santos-Buelga della Facoltà di Farmacia dell'Università di Salamanca. Infine, nell'ambito di piante con interesse farmaceutico, è stata sviluppata un’affidabile ed efficace tecnica analitica per l'analisi dei principali cannabinoidi non psicoattivi contenuti nelle infiorescenze di canapa da fibra. L'analisi dei cannabinoidi negli estratti è stata condotta sviluppando un nuovo metodo RP-HPLC accoppiato con rilevazione UV / DAD e ESI-MS2, sfruttando, anche in questo caso, la fase stazionaria fused-core. Il metodo analitico sviluppato è stato applicato anche a prodotti farmaceutici a base di canapa per determinarne il titolo in composti bioattivi. Inoltre, diverse varietà di canapa sono state selezionate per la preparazione di estratti ricchi in cannabinoidi con il fine di testare la loro attività neuroprotettiva in vitro, in colalborazione con il Dr Lorenzo Corsi del Dipartimento di Scienze della Vita dell’Università di Modena e Reggio Emilia. Parlando di cannabinoidi, la determinazione del loro contenuto in prodotti alimentari ricopre grande importanza nell'ottica della loro assunzione tramite dieta e nel controllo di qualità. In questo contesto è stato ottimizzato un metodo RP-HPLC con rilevazione ESI-MS / MS per l'analisi dei cannabinoidi non psicoattivi nei prodotti dell’alveare. Inoltre, nell’ambito del progetto di dottorato, è stato dato un contributo significativo ad altri progetti finalizzati allo studio di composti bioattivi di particolare interesse fitochimico, come quelli presenti in Humulus lupulus L. e Uncaria tomentosa (Willd.) DC. In conclusione, il lavoro del mio dottorato di ricerca dimostra la grande importanza che ricoprono lo sviluppo di metodi analitici efficaci e l’ottimizzazione di opportune procedure di estrazione nella ricerca sui prodotti naturali, al fine di evidenziare il loro valore nutraceutico e farmaceutico.
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Abstract
Natural products are complex mixtures of active compounds (also known as secondary metabolites), that may act synergistically in many cases. In this view, the complete definition of all the phytochemical constituents of a natural product represents a key point to ensure the efficacy, reliability and safety in its use and to enhance its quality control. In this context, the development of advanced analytical methods for the qualitative and quantitative analysis of bioactive natural compounds is extremely important.
In the light of this, my PhD project was focused on the development of highly efficient and innovative analytical techniques for the comprehensive multi-component analysis of bioactive secondary metabolites in different natural products, including two plants of nutraceutical interest (Punica granatum L. and Vaccinium myrtillus L.) and one plant of pharmaceutical interest (Cannabis sativa L.).
Initially, a new analytical method for the metabolite fingerprinting of polyphenols in P. granatum L. juice and peels was developed. The qualitative and quantitative analysis of pomegranate secondary metabolites was performed by HPLC-UV/DAD and HPLC-ESI-MS2 analyses. The application of the fused-core column technology allowed us to obtain an improvement of the HPLC performance in comparison with that of conventional particulate stationary phases.
Always in the ambit of polyphenolic compounds, the metabolite profiling of anthocyanins in V. myrtillus L. berries and derived food products was carried out in this work in order to assess their quality in terms of bioactive compounds. This was achieved by means of a RP-HPLC method, with both UV/DAD and ESI-MS detection. As regards the biological activity, the bilberry extracts were submitted to in vivo experiments to test antioxidant activity of bilberry anthocyanins, by using the Caenorhabditis elegans model, in collaboration with Prof. Celestino Santos-Buelga of the Faculty of Pharmacy of the University of Salamanca.
Finally, in the ambit of plants with pharmaceutical interest, a new, efficient and reliable technique for the extraction and chromatographic analysis of the main non-psychoactive cannabinoids in fibre-type C. sativa inflorescences was developed. The analysis of cannabinoids in the extracts was carried out by developing a new RP-HPLC method coupled with UV/DAD and ESI-MS2 detection, taking advantage of the fused-core stationary phase also in this case. The analytical method was applied also to hemp-based pharmaceutical products to determine their content of bioactive compounds. In addition, different hemp varieties were selected for the preparation of cannabinoids-rich extracts in order to evaluate their neuroprotective activity by using in vitro cellular models, in collaboration with Dr. Lorenzo Corsi of the Department of Life Sciences of the University of Modena and Reggio Emilia.
In the ambit of cannabinoids, the analysis of their amount in food products is an important issue for both the quality assurance and the dietary intake of these biologically active compounds. In this context, a RP-HPLC method with ESI-MS/MS detection was optimized for the analysis of non-psychoactive cannabinoids in apiary products.
As part of this PhD project, a significant contribution was given also to other collateral research projects, for the study of bioactive compounds of peculiar phytochemical interest, such as those present in Humulus lupulus L. and Uncaria tomentosa (Willd.) DC.
In conclusion, the research work of my PhD demonstrate the great importance of the development of efficient analytical methods, together with the establishment of suitable extraction procedures, in the research on plant derived natural products in order to highlight their nutraceutical and pharmaceutical value.
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