Riassunto analitico
L'evoluzione delle metodologie di sequenziamento dell'intero genoma ha portato ad una profonda comprensione delle funzioni dei geni e allo sviluppo di tecnologie avanzate per modificare il genoma umano. La terapia genica e il gene editing sono state sviluppate con l'obiettivo di trattare malattie genetiche rare incurabili. Il sistema di gene editing CRISPR/Cas si basa sull'utilizzo di un RNA guida (gRNA) in grado di appaiarsi ad una regione genomica prescelta che potrebbe contenere una mutazione. CRISPR/Cas9 introduce un taglio a doppio filamento (DSB) che viene successivamente riparato attraverso “non homologous end joining” (NHEJ) o ricombinazione omologa (HDR) in presenza di un templato di DNA donatore. La modificazione di una singola base del DNA mediante il sistema CRISPR è una nuova strategia che permette la transizione di base ed è stata sviluppata con lo scopo di correggere le mutazioni evitando il DSB a livello del DNA. Questa tesi descrive l'utilizzo del sistema CRISPR/Cas9 nel trattamento di due forme della distrofia muscolare Emery Dreifuss (EDMD) dovuta a mutazioni nel gene LMNA (EDMD2) o EMD (EDMD1). EDMD2 è dovuta a mutazioni missenso nel gene LMNA situato sul cromosoma 1 e codificante per la Lamina A e C. EDMD1 è dovuta a mutazioni non senso nel gene EMD situato sul cromosoma X e codificante emerina. Lamina A, C ed emerina sono importanti proteine dell’involucro nucleare e loro difetti portano ad una anomala formazione del rivestimento nucleare, alla dislocazione delle proteine della membrana nucleare interna, al raggruppamento dei complessi dei pori nucleari e alla rottura del trasporto nucleo-citoplasma tessuto-specifico. Ad oggi, esistono pochi trattamenti per EDMD e sono per lo più basati su farmaci in grado di contrastare i sintomi. La terapia genica potrebbe rappresentare un trattamento utile e permanente per tale malattia. In questa tesi ho testato la tecnologia CRISPR/Cas9 per la correzione di 2 mutazioni nel gene LMNA ed 1 mutazione nel gene EMD. Le mutazioni nel gene LMNA sono mutazioni missenso che vengono ereditate con un tratto autosomico dominante, pertanto proponiamo di distruggere specificamente l'espressione della lamina A dall'allele mutato conservando l'allele wild type (WT). Due gRNA specifici per le due diverse mutazioni sono stati progettati e clonati in un plasmide effettore che esprime la versione WT o la variante high fidelity della Cas9 derivata da S. pyogenes (SpCas9). Per testare questa strategia in una linea immortalizzata di cellule umane (HEK293T), la regione mutata e WT del gene LMNA sono state clonate in due plasmidi templato. Plasmidi templato e plasmidi effettore sono stati co-trasfettati in cellule HEK293T, e l'efficienza di taglio sul templato wt o mutato è stata verificata tramite Sanger sequencing and Tracking of Indels by Decomposition (TIDE) analysis. Per correggere la mutazione non senso nel gene EMD abbiamo impiegato il sistema di cytidine base editing (CBE) basato su CRISPR/Cas che sostituisce una Citosina con una Timina senza introdurre DSB nel gene EMD. È stato progettato un gRNA clonato nei plasmidi effettori AncBE4max e BE4max che esprimono la nickase Cas9, la deaminasi APOBEC1 e l'inibitore della uracil-glicosilasi (UGI). Per testare questa strategia di base editing in HEK293T la regione mutata del gene EMD è stata clonata in un plasmide templato. Il plasmide templato ed i plasmidi effettore sono stati co-trasfettati in cellule HEK293T e, l’efficienza di CBE editing sul templato mutato è stata verificata attraverso sequenziamento Sanger. Dopo aver testato il gRNA in HEK293T, il sistema di CBE base editing verrà introdotto in fibroblasti cutanei di paziente che porta questa specifica mutazione nel gene EMD.
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Abstract
The evolution of whole genome sequencing methodologies lead to a deep understanding of genes functions and to the development of advanced technologies to modify the human genome. Gene therapies in general and gene editing were developed with the aim of treating incurable rare genetic diseases. The CRISPR/Cas gene editing system is based on the use of a RNA guide (gRNA) able to target the region affected by the mutation. CRISPR/Cas9 introduces a double strand break (DSB) that is further repaired through non homologous end joining (NHEJ) or homology directed repair (HDR). CRISPR-mediated base editing is a new strategy that leads to base transition and it was developed with the purpose to correct mutations avoiding DSB into the DNA. This thesis describes the use of CRISPR/Cas9 system in the treatment of two forms of Emery Dreifuss muscular distrophy (EDMD) due to mutations in LMNA (EDMD2) or EMD gene (EDMD1). EDMD2 is due to missense mutations in LMNA gene located on chromosome 1 and encoding for lamin A and C protein. EDMD1 is due to non sense mutations in the EMD gene located on chromosome X and coding for emerin protein. Lamin A, C and emerin are important proteins of the nuclear envelope and their defects lead to an abnormal formation of the nuclear coating, mislocalization of inner nuclear membrane proteins, clustering of nuclear pore complexes and disruption of tissue-specific nucleo-cytoplasmic transport. To date, there are only few treatments for EDMD, based on drugs that counteract symptoms. Gene therapy could represent a valuable and permanent treatment for this disease. In this thesis I tested CRISPR/Cas9 technology to correct 2 mutations in LMNA gene and 1 mutation in EMD gene. The mutations in LMNA gene are missense mutations that are inherited with a autosomal dominant trait thereby we propose to specifically destroy the expression of lamin A from the mutated allele preserving the wild type (WT) allele. Two gRNAs specific for the two different mutations were designed and cloned into a effector plasmid expressing the humanized WT and high fidelity S. pyogenes Cas9 (hSpCas9). To test this strategy in human cells line, the mutated and WT region of the LMNA gene were cloned into two template plasmids. Effector and template plasmids were co-transfected in HEK293T cells, and cleavage efficiency on wt or mutated templates were verified by Sanger sequencing and Tracking of Indels by Decomposition (TIDE) analysis. To correct the non sense mutation in the EMD gene we employed the cytidine base editing (CBE) base on CRISPR/Cas which replace a C with a T nucleotide without introducing DSB in the EMD gene. A gRNA was designed and cloned into AncBE4max and BE4max effector plasmids expressing the Cas9 nickase, the APOBEC1 deaminase and the inhibitor of uracil glycosilase (UGI). To test this base editing strategy in human cell line, as well as for LMNA mutations, the mutated region of the EMD gene were cloned into a template plasmid. The effector and template plasmids were co-transfected in HEK293T cells and editing efficiency on mutated template was verified by Sanger sequencing. Once the gRNA was tested in HEK293T, the base editing system will be delivered in skin fibroblast from patient.
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