Riassunto analitico
La trasparenza della cornea è fondamentale per la corretta funzione oculare e viene mantenuta grazie al continuo rinnovo delle cellule staminali corneali che risiedono nel limbus, una stretta area al confine tra cornea e congiuntiva.
Danni chimici, fisici ed ustioni possono distruggere il limbus causando un quadro patologico noto come “deficit di cellule staminali limbari”. In questi casi, il riparo del danno avviene attraverso l’attivazione della congiuntiva che ricopre la cornea, secondo un processo chiamato “congiuntivalizzazione” che porta alla neovascolarizzazione e cicatrizzazione corneale nonchè perdita della vista.
L'unico modo per prevenire la congiuntivalizzazione della cornea è ripristinare il limbus con cellule staminali limbari autologhe. Questo è possibile grazie al trapianto di lembi di epitelio limbare ottenuti coltivando in vitro cellule estratte dalla biopsia dell'occhio sano. Questa terapia è commercializzata dal 2015 con il nome di Holoclar.
Sfortunatamente, se il danno colpisce entrambi gli occhi, non è più possibile estrapolare delle cellule staminali autologhe dall'occhio sano per la terapia.
Lo scopo di questa tesi è quindi ottenere una nuova fonte di cellule staminali limbari attraverso la riprogrammazione di cheratinociti ottenuti dalla pelle di pazienti affetti da LSCD bilaterale,
sfruttando la similarità genetica, epigenetica e funzionale tra i cheratinociti di pelle e di limbus.
Tramite analisi clonali abbiamo isolato le cellule staminali da questi epiteli. Tramite microarray abbiamo analizzato il profilo trascrizionale di tali cellule. Tramite analisi bioinformatica abbiamo ottenuto una predizione dei geni capaci di indurre la riprogrammazione di cheratinociti epiteliali in cheratinociti limbari.
Fra i geni ottenuti dalla predizione bioinformatica, abbiamo deciso di utilizzare Pax6, Pitx1, Meis1 in base ai dati forniti dalla letteratura. Ho quindi caratterizzato l’espressione di questi geni nei due tipi cellulari e ho valutato la loro efficacia nell'indurre la riprogrammazione cellulare.
E' stata analizzata l'espressione di diversi geni target al fine di vedere quale di essi potesse fungere da marcatore di reprogramming. Tra di loro abbiamo visto che la cheratina12 (K12), ZFP42 e FOXA2 sono molto espressi solo nel limbus mentre quasi del tutto assenti nella pelle e possono, quindi, essere utilizzati per monitorare il processo di riprogrammazione.
Successivamente, i cheratinociti di pelle coltivati in vitro sono stati trasdotti con un vettore lentivirale contenente i geni predetti in silico.
Al fine di aiutare la sopravvivenza cellulare, la coltura è stata condotta in presenza di inibitori di GSK3 e di ROCK. In aggiunta a ciò, per facilitare l'accesso di questi fattori di trascrizione alla cromatina, le cellule sono state sottoposte ad un singolo trattamento di 21 ore con acido valproico.
In seguito a trasduzione abbiamo ottenuto un’alta percentuale di cellule esprimenti i tre fattori, anche se questa percentuale è andata progressivamente calando nei passaggi successivi. Tuttavia, già dopo 14 giorni in coltura abbiamo potuto osservare la comparsa di cheratinociti epiteliali trasdotti con il vettore policistronico ed esprimenti K12, cheratina precedentemente dimostrata come specifica del limbus.
In conclusione, questi dati suggeriscono che Pax6, Pitx1 e Meis1 possono indurre la riprogrammazione a cheratinociti limbari.
Per selezionare le cellule riprogrammate saranno implementati sistemi che prevedono l'espressione di un antibiotico resistenza da parte delle cellule riprogrammate. In questo modo sarà possibile ottenere una popolazione pura di sole cellule riprogrammate che potranno essere studiate in maniera più esaustiva.
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Abstract
Corneal transparency is critical for proper ocular surface function and is maintained by self-renewing stem cells derived from limbus, the narrow zone between the cornea and the bulbar conjunctiva.
Many events, as ocular burns, mechanical, chemical or physical damages may destroy the limbus, causing limbal stem cell deficiency (LSCD). In such cases, the bulbar conjunctival cells invade the corneal area, leading to neovascularization, corneal scarring and loss of vision. The only way to prevent conjunctival invasion is to restore the limbus with autologous limbal stem cells. This can be done through the transplantation of in vitro cultivated limbal stem cells derived from a biopsy of the healthy eye. This therapy is the first stem-cells based therapy approved in EU and commercialized from 2015 with the name of Holoclar.
Unfortunately, if the damage involves both eyes (bilateral LSCD), it is not possible to obtain autologous limbal stem cells for this therapy.
My project aims to obtain a new source of limbal stem cells through the reprogramming of keratinocytes derived from the skin of patient affected by bilateral LSCD relying on the similarity of the behavioural, epigenetic and genetic programs of epidermis and limbus.
Through several clonal analysis we isolated stem cell from these epithelia and analysed their transcriptional profile. Through a bioinformatic analysis, we got a prediction of genes able to determine a switch from epidermal into limbal keratinocytes.
Among all the genes obtained, we focused on the transcriptional factors Pax6, Meis1 and Pitx1, which are somehow connected with eye development from the literature.
Therefore, I characterized the expression of these genes in limbus and epidermis and I evaluated their efficacy in inducing reprogramming.
Several targets have been tested in order to see which can be used as reprogramming markers. Among all, we found keratin 12 (K12), FoxA2 and ZFP42 highly expressed in limbus while almost absent in skin and therefore they can be used to track the cell type switch.
Successively, in vitro cultured epidermal keratinocytes have been transduced with a polycistronic lentiviral vector expressing the aforementioned predicted genes.
In order to help reprogramming, the cell culture has been carried out in the constant presence of GSK3 inhibitor and ROCK inhibitor. In addition, in order to facilitate the access to the chromatin of the predicted transcription factors, the cells have been subjected to Valproic acid for 21 h.
After transduction we obtained a high percentage of cells expressing the three factors, even though a sharp decrease of this value can be observed with passages.
However, after 14 days from transduction we observed some transduced epidermal keratinocytes expressing K12, keratin previously shown being limbus specific.
In conclusion, these data suggest that Pax6, Meis1 and Pitx1 could act as limbus to epidermis reprogramming genes.
In order to select reprogrammed cells, we will develop a system inducing an antibiotic resistance in the reprogrammed cells. In this way, it will be possible to get a pure reprogrammed population of cells for further studies.
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